高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法

1、每天用足够的时间来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的补偿，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！- 一定得做！ 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装（不加预柱） 1将卡套架套入柱芯 2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用

2、卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1将卡套架套入柱芯 2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4将子弹头预柱放入卡套片内 5将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7连接到液相色谱仪，PEEK接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗，而且修补工具的头部也应

3、该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉3，取出柱芯顶端的滤网 4用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7柱芯顶端套上2，然后参照（左图）将滤网放入 8压紧，然后取下2，再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/

4、水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用1020倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水过渡。 硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡 如何平衡色谱柱？ 平衡过程中，将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡） 色谱柱的再生 进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。 表1建议用来冲洗的溶剂体积 色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的

5、体积 125-4 1.6ml 30ml 250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 请根据下表选择您的再生方法： 极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生： 正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水* 非极性固定相（如反相色谱填料RP18，RP8，CN等）的再生： 水乙腈氯仿（或异丙醇）乙腈水 0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱 注意： 在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 *如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀

6、硫酸冲洗非常有效。 色谱柱的维护 1使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） 2大多数反相色谱柱的pH稳定范围是27.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围 3避免流动相组成及极性的剧烈变化 4流动相使用前必须经脱气和过滤处理 5如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法1 色谱柱跑干了，处理方法：将贮液瓶装入重蒸水，首先按purge键，将柱前气柱排出，若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。2.基线不稳，有静电，处理方

7、法：检查接地是否良好。3.峰面积变化非常大，处理方法：检查是否进样阀堵塞。4.基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。高低流速交替冲洗。6.柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。 7塔板数低 ：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响8色谱柱易变性：色说柱选择不对，二次保留的影响9色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理（PH7）10保留值变化：色谱柱平衡不够，流动相比例改变11出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性 选择波长要从以下几个方面考虑：1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂

8、有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。2. 对各组分都要有适当的吸收。一般是不可能做到的。所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。对饱和基团也有弱的吸收。而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。 （一）涡流扩散（Eddy diffusion）流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块

9、或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。（二）分子扩散（Molecular diffusion）分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。（三）质量转移（Mass transfer）被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就

10、向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。四）动相流速当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速咖大会降低柱效率。五）固定相颗粒大小定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。 1、开泵后压力即升高至最高限度，经过对色谱柱前，色谱柱，色谱柱后的分段测试，确定为检测池堵塞。2、换检测波长后，色谱峰面积比以前做的小很多，怀

11、疑进样环或管路漏夜，经检查，排除，最后确定为，检测波长的显示值和实际值不符。 由气味、景象和声音可以发现的问题你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。A、溶剂的气味原 因 解决方法1、漏液 1、见前2、溅出 2、a、检查废液瓶是否已满 b、找到溅出的部位并清洗干净B、热气味原 因 解决方法1、仪器过热 1、a、检查并调节通风设施 b、检查并调节温度设定c、关掉仪器，查找维修手册C、读数不正常

12、原 因 解决方法1、压力不正常 1、见前2、柱温箱问题 2、a、检查并调节设定 b、参照用户手册3、检测器灯失效 3、更换灯D、灯警告原 因 解决方法1、压力超出极限值 1、a、检查是否阻塞 b、检查并调节极限值的设定2、其它警示灯 2、见用户手册E、警告音原 因 解决方法1、溶剂泄漏/溅出 1、找到并解决2、其它警告音 2、见用户手册F、刺耳的短音或长音原 因 解决方法1、轴承失效 1、见用户手册2、润滑不够 2、进行恰当的润滑3、机械故障 3、见用户手册 进样阀可能发生的问题A、手动进样阀，转动不灵原 因 解决方法1、转子密封损坏 1、更换或调整转子密封2、转子太紧 2、调整转子的松紧度B

13、、手动进样阀，载样困难原 因 解决方法1、进样阀安装不当 1、重新安装2、定量环阻塞 2、清洗或更换定量环3、进样器污染 3、清洗或更换进样器4、管路阻塞 4、清洗或更换管路C、自动进样阀，不能转动原 因 解决方法1、无压力（或电源） 1、提供恰当的压力（电源）2、转子太紧 2、调整转子的松紧度3、进样阀安装不当 3、重新安装D、自动进样阀，其它问题原 因 解决方法1、阻塞 1、清洗或更换阻塞部件2、机械故障 2、见随机维修手册3、控制器故障 3、维修或更换控制器 HPLC柱压过高：1.拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2.把色谱柱从仪器上取下来，如果压力仍然

14、不降，则是管路堵塞，须清洗，如果压力下降了，将柱子的进出口反过来接再仪器上，用10倍量柱体积的流动相冲洗柱子，如果柱压仍不降，再检查3.更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明溶剂获样品中含有固体颗粒，若柱压还高，可在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器基线不稳，上下波动或漂移1。流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟2。单向阀堵塞，取下超声去除堵塞物3。泵密封损坏，造成压力波动，更换泵密封4。系统存在漏液点，确定漏液位置并维修5。流通池内有赃物或者杂质，清洗杂物6。柱后产生气泡，流通池出液口加负压调节器7。检测器没有设定在最大吸收波长处8。柱平衡慢，特别是流动相发生变化时。用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的心流动相对柱子进行冲洗 1.检测信号出现倒峰，检查检测器与主机相连接是否有松动，可以把下重新连接。2.夏季气温高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。3.由甲醇换到流动相平衡时，压力先稍稍下降，然后慢慢回升，可能是混合池混合效果不好，也可能是B泵轻度堵塞。4.色谱柱长期不用，应用甲醇冲洗2h以上后，宁上两端螺丝保存。 岛津机器易出现的毛病是：1、压