HPV疫苗的制备

1、HPV疫苗的制备及作用效果HPV是一类能够感染皮肤和粘膜的DNA病毒。高危型HPV是宫颈癌以及癌前病变 的要致病因子，99.7%的宫颈癌组织都检测出高危型HPV。针对HPV感染，人类自身所产生的免疫应答主要分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫 主要表现为HPV刺激机体B细胞产生抗HPV L1、L2蛋白的抗体，但是由于产生抗体 的量特别少，所以很难检测到这些特异性抗体，阻碍了人们对体液免疫的相关研究。细胞免 疫主要表现为T细胞受HPV刺激后通过释放淋巴因子来杀死感染病毒的细胞1, 2。目前预防和治疗HPV相关癌症最有效的方法是研制其特异性的HPV疫苗，诱导机体 产生中和抗体，激发保护性免疫反应，以达

2、到预防HPV相关癌症发生和传播的目的，既可 以降低宫颈癌的发病率，也可降低与HPV感染有关的其它癌症的发病率。人类乳头瘤病毒（HPV）是一种无包膜的双链闭环小分子DNA病毒，属乳头多瘤空病毒 科乳头瘤病毒属。其基因约8kb，只有1条DNA链可作为转录模板，含8个开放阅读框（open reading frames， ORFs），分 3 个基因区，即早期区（early region， E 区）、晚期区（late region， L区）与非编码区（uncoding region， UCR） 或上游调控区（URR）。E区编码 E1，E2, E4, E5，E6，E7等早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录

3、、翻译调控和转化等功 能；L区编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2； UCR区含有HPV基因组复制起点和HPV 表达所必需的调控元件。由HPV产生的两种癌蛋白是E6和E7,可以抑制细胞周期负调 节因子的活性，并可以在肿瘤细胞中高度表达。而晚期基因则编码衣壳的结构蛋白，其中主 要衣壳蛋白L1结构保守，是HPV衣壳的主要成分，约占衣壳蛋白的80%以上，因此成为 理想的预防免疫靶位。基于HPV的致病机制和天然的免疫原性，HPV疫苗研究聚焦于L1、E2、 E5、E6 和 E7。目前HPV的疫苗主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要诱导机体体液免疫 反应，产生的中和性抗体在HPV进入机体前即能

4、与病毒的抗原结合，从而防止HPV的感染。 治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化效应性T细胞能识别和攻击HPV感 染的细胞，其中也包括HPV引起的恶性肿瘤细胞。（一）HPV预防性疫苗预防性疫苗的制备依据及过程预防性疫苗一般以HPV主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原3,其作用在于 诱发肌体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应以阻止HPV的长期感染和再感 染。HPV的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时，能自我装配或形成病毒样颗粒 （virus-like particles, VLPs）,其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，将其置入机体后 可刺激产生中和抗体IgG和I

5、gA4，达到预防相应型别HPV的感染，而且不包括病毒 DNA，安全性好，能有效地保护人类和动物免受乳头瘤病毒的感染以及产生相关肿瘤的可 能性5,6。VLPs颗粒直径为50-55nm，分子量为55-60kDa，VLPs是由纯化的L1蛋白装配 形成HPV的空衣壳。VLPs的最小结构单元是L1蛋白单体，L1蛋白主要是由8条反向 平行的0折叠肽链段构成的，它们之间是由无规则的环形区（loop）连接在一起的，每个环 形区大约有1030个氨基酸（aa），这些区域绝大部分延伸到五聚体和病毒颗粒的外表面， 是抗原表位的所在区域7-9；不同型别HPV环形区的序列和空间结构是不同的，所以HPV 具有高度的型别特异

6、性。因此，目前对于HPV抗原表位的研究主要集中在L1蛋白的环 形区上10。国内外有多家机构在进行HPV疫苗的研究及其制备，大部分都是以L1和（或）L2 蛋白为靶标进行制备的（单独表达L1或者联合表达L1+L2,获得病毒样颗粒（VLP）。一般 步骤都是针对HPV L1和（或）L2蛋白的核酸序列为基础，对其进行改造优化（例如密码子优化，删除部分序列，替换某个/些碱基，连接其他基因等），扩增或者合成优化后的序列， 然后将其克隆到表达载体上，并在原核系统（例如大肠杆菌）或者真核系统（例如昆虫细胞， 酵母，哺乳动物细胞等）进行表达，再将表达的单个蛋白或者融合蛋白分离纯化，添加佐剂 后制成疫苗，通过将制成

7、的疫苗免疫小鼠或者其他动物对其免疫原性进行评价，效果较好的 进行临床实验。已经被批准上市的预防性疫苗目前已经被批准上市的预防性HPV疫苗有两种，它们分别是英国葛兰素（GlaxoSmithKline， GSK）公司的双价疫苗 “Cervarix” 和美国默克（Merck & Co., Inc.）公 司生产的四价疫苗“Gardasil”（商品名）11。随着这两种疫苗的上市，人们对宫颈癌疫苗 的研究主要集中在HPV VLPs疫苗上。2006年，“Gardasil”被批准上市，这是第一个商品 化的宫颈癌预防性疫苗，它是由两个高危型 HPV16、18和两个低危型HPV6、11的 L1-VLPs组成的重组

8、混合型疫苗，它们使用酿酒酵母体系产生 VLPs，佐剂为氢氧化铝（225ug）。2007年，英国葛兰素公司的“Cervarix”（商品名）疫苗上市12，它是HPV16、 18的L1-VLPs组成的重组混合型疫苗，利用重组杆状病毒感染的昆虫细胞（粉纹夜蛾）产 生VLPs，佐剂为传统铝盐（500ug）加上AS04（50ug）13, 14。这两种疫苗都是预防性的， 不是治疗性的，主要接种于未发生HPV感染的人群，用来预防HPV感染以及相关疾病的 发生。这两种疫苗的抗原都是HPV主要衣壳蛋白的L1。临床试验结果证明，上述疫苗均具 有良好的耐受性，且没有严重的不良反应，抗体效价比自然感染HPV的患者高50

9、倍。此外， 最近 Merck公司又研发出了 Gardasil九价预防性疫苗（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）。 Gardasil已在117个国家或地区被批准使用，全球33个国家多中心的联合试验结果表明， 疫苗对宫颈癌、癌前病变以及其他生殖道疾病的预防作用可达99%100%； Cervarix疫苗 对HPV16和HPV18所致CIN 11、111的保护效力达到100%； Merck公司的九价疫苗已经 于2015年进入三期临床试验。二价疫苗针对HPV16、18产生的保护性抗体均可维持100% 的血清阳性至少8.4年15；四价疫苗针对HPV16产生的保护性抗体能维持98.8

10、%的血清 阳性至少5年口。其他处于研究阶段的预防性疫苗（部分）Xie等17在杆状病毒昆虫细胞中表达纯化了 HPV 16,18,58 LI VLPs，对各型VLPs进 行了纯度、形态学及免疫原性的研究，特别是HPV58L1 VLPs诱发长期中和抗体活性及协 同A1（0H）3佐剂的相关研究。在此基础上，表达及纯化了以HPV16L1 VLPs为载体的嵌合各 种HPV 16 L2保守表位的杂合蛋白，并对影响杂合L1组装能力及其诱发中和抗体活性的 因素进行了研究。HPV LI VLPs免疫小鼠测定ED50，将HPV 16,18,58 LI VLPs单独或混合 免疫小鼠诱发了较高滴度的针对组成型别的中和抗

11、体，表明HPV16,18,58 LI VLPs免疫原性 很强。韩国的金洪珍等18通过优化16型和18型的HPV序列，构建至pUCminvsMCS载体 及YEG-MCS酵母表达载体，以酿酒酵母为宿主菌进行表达，通过肝素层析和阳离子交换层 析进行表达蛋白的纯化并进行浓缩。纯化得到的蛋白添加佐剂后免疫小鼠，发现组合佐剂增 加了免疫刺激效果，总IgG效价增高。该药物疫苗组合物可比常规疫苗（包括CervarixTM 及GardasilTM）诱导更强的针对HPV的免疫应答，因而具有优良的宫颈癌预防功效。此外， 该药物疫苗组合物由于用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性LOS几乎无细胞毒性而具有优良 安全性。该药物

12、疫苗组合物比施用CervarixTM及GardasilTM显著提高与Th1型免疫应答 （细胞免疫）相关的干扰素-Y、IgG2a及IgG2b水平，以及与Th2型免疫应答（体液免疫） 相关的IgG1水平。总体来说，本药物疫苗组合物可诱导均优于CervarixTM及GardasilTM 的针对HPV的Th1型免疫应答（细胞免疫）及Th2型免疫应答（体液免疫）。厦门大学的李少伟等19对全长HPV31L1基因依照大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化（片段全长为1515bp,终止密码子为TAA）,由上海博亚公司合成该基因，酶切后与非融合 表达载体pTO-T7连接，转入ER2566大肠杆菌，用50L的发酵罐进行大规

13、模培养，用IPTG 进行诱导表达，之后分离纯化（HPV31Ctag-L1的阳离子交换色谱）L1蛋白，对得到的蛋 白通过Western和质谱进行鉴定，用CENTRASETTE5切向流系统对L1蛋白进行组装，对 HPV31L1病毒样颗粒进行透射电镜观察和动态光散射检测。将制得的该病毒样颗粒稀释至 0.1mg/ml，然后加入等体积的完全弗氏佐剂等体积的不完全弗氏佐剂，免疫小鼠/兔子后进 行免疫保护性的评价。发现通过该方法获得的HPV31-L1病毒样颗粒具有良好的免疫原性， 可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预防HPV31感染的疫苗。马润林等20克隆了 HPV16 L1衣壳蛋白基因，进行修饰

14、（碱基替代）后在大肠杆菌中表 达（表达质粒为pGEX-6-1，表达菌株为BL21），分离，经亲和色谱纯化重组HPV16L1蛋 白五聚体（该五聚体与HPV16 L1蛋白的VLP具有相同的免疫原性和抗原性），将所得重组 HPV16 L1蛋白五聚体与辅料（佐剂包括吕盐/3-O-去酰化单磷酸类脂/脂质A衍生物，赋型 剂包括生理水以及其它药物上可接受的赋型剂，稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液）混合 制剂，得到16型重组人乳头瘤病毒疫苗。具体步骤为将纯化的HPV16 L1的五聚体与100mM NaCl的标准磷酸缓冲液混合（pH7.2），加入150ug氢氧化铝，调整五聚体浓度至10业/支， 制成疫苗。动物安

15、全性实验发现重组HPV16疫苗对供试动物未发现任何可观测到的急性毒 性和异常毒性，全部毒性检测指标为阴性。动物有效性试验发现组HPV16疫苗能诱导供试 动物产生强烈的抗体保护反应，抗体有效中浓度ED0在0.4-2.0微克，抗原的免疫原性及抗 体的滴度水平很高。（二）HPV治疗性疫苗在感染HPV所引起的的恶性肿瘤细胞中，病毒DNA整合到宿主细胞DNA中，结果导 致E6、E7基因异常过量表达而使细胞无限增殖，并最终向恶性转化；同时，晚期蛋白L1、 L2基因会断裂丢失，使其不能表达或仅有部分蛋白被低水平表达而难以检测到，因此预防 性疫苗对已经感染HPV并引起癌前病变的的患者没有保护能力，不能使他们被

16、治愈。研究 表明，HPV感染引发的癌前病变以及癌症的发生主要是由HPV E6、E7的协同作用所致， 因此针对E6、E7为靶抗原的HPV治疗性疫苗成为研究的重点21, 22,23, 24。治疗性疫苗的制备主要依据由于HPV E6/E7蛋白具有致癌性，将这两种蛋白直接应用于治疗宫颈癌时会存在疫苗的 安全隐患，通常对关键位点进行突变以降低致癌性。通过对HPVE6蛋白和E7蛋白结构功能 和突变体的深入研究，可以有靶向性地对E6和E7基因进行突变和改造，消除E6蛋白和E7 蛋白的致癌能力和转化活性，从而降低了将HPV E6/E7蛋白应用于治疗性疫苗开发的风险， 保证安全性。对HPV E6/E7基因进行突

17、变，使其失去致癌性，同时保留免疫原性是研制宫颈 癌治疗性疫苗的主要手段之一25。治疗性疫苗的种类及制备HPV治疗性疫苗的类型主要有：多肽/蛋白质疫苗26、活病毒载体疫苗、DNA疫苗、 RNA疫苗27。目前尚无有效的HPV治疗性疫苗问世。但重组蛋白疫苗、多肽疫苗已进 入二期临床试验，并显示出良好的前景。蛋白疫苗：多肽/蛋白疫苗是采用肿瘤特异性的多肽片段或抗原蛋白作为疫苗直接免疫 机体，诱导机体产生抗原特异性的CTL反应来杀伤肿瘤细胞。Chen等首先证实，HPV16 E7 免疫动物可获得特异性CD8阳性淋巴细胞介导的肿瘤排斥反应。Bermudez Humaran等28 通过乳酸乳球菌生产HPV16

18、 E7蛋白。多肽疫苗：多肽疫苗的作用原理与蛋白疫苗类似Liu等构建了一种新型的疫苗E7蛋 白CTL表位4462和热休克蛋白（Hsp70 ）的融合多肽疫苗29，使用rAAV作为载 体，动物实验中显示出良好的肿瘤保护作用，转染效率高，且使用rAAV可使作用延至l5年， 避免反复使用及由此产生的中和抗体。活载体疫苗：活载体疫苗是将肿瘤特异性抗原蛋白的基因插入活载体（细菌或病毒等）， 高效表达抗原从而刺激抗原特异性的免疫反应。活载体疫苗免疫原性高，作为抗原载体的免 疫刺激效果好。但是，活载体可能有潜在的安全风险，尤其是对于免疫功能不全的患者。常 用疫苗的载体主要有病毒（牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒和a

19、病毒等），细菌等。Li等30 采用天坛牛痘株构建了表达HPV16和18 E6/E7蛋白的重组牛痘病毒疫苗rVVJ 16/18 E7E6, 在对小鼠和恒河猴的研究中，该疫苗均显示细胞免疫反应，而且对小鼠的肿瘤移植保护实验 也显示出一定的效果。田厚等31，将HPV16型早期蛋白E7、E6编码区基因融合，并将 E7、E6编码区基因进行改造修饰去除其转化活性，保留抗原性，再根据哺乳细胞使用密码 子的偏嗜性设计其相应的优势密码子核酸序列交给公司合成。将合成的经密码子优化过的 E7E6融合基因插入到腺病毒重组载体质粒pCD316中，与Ad5病毒载体骨架质粒共转染293 细胞，经纯化并进行E7E6融合基因及蛋白的鉴定，筛选出表达人乳头瘤病毒HPV16型E7E6 融合蛋白的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，扩增重组病毒，经动物免疫实验评价，表明所制 备出的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6具有免疫活性，其能够诱发免疫动物产生针对HPV16E7 的特异性T细胞介导的细胞免疫应答，对肿瘤的生长有明显抑制作用。DNA疫苗：Smahel等使用修饰了的HPV16E7基因DNA疫苗进行体外实验32，在E7 基因Rb结合点加入3个突变位点GGG，实验对比4种疫苗的作用：E7、ETGGG及2种融合 基因L16c E