成体干细胞概述和体外培养及特性

1、成体干细胞概述和体外培养及特性 概述成体干细胞分化的可塑性 成体干细胞的体外培养和特性 成体干细胞研究中的问题 成体干细胞在再生医学中的应用 概述一、定义成体干细胞是指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞,又称组织特异性干细胞(Tissue-specific stem cell)。 传统观点 干细胞一旦分化成熟，就不再分裂增殖了；成体干细胞的发育潜能是限能或少能的；成体干细胞只能分化为特定组织器官若干类型细胞。 转折点1997年初，英国科学家Wilmut等用体外培养、高度分化的母羊乳腺细胞核移植入去核卵细胞，克隆出了 “Dolly”。

2、 表明某些高度分化的体细胞核仍具有一套完整的遗传信息，能指导胚胎发育成为一个完整的新个体。 在特定的条件下，分化的体细胞仍具发育的全能性。 与胚胎干细胞相比，成体干细胞具有许多优势：成体干细胞不存在组织相容性的问题，治疗时可避免长期应用免疫抑制剂对患者的伤害。胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的。目前，尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，容易导致畸胎瘤。成体干细胞也具有类胚胎干细胞的高度分化能力。二分 化目前，比较一致的看法是： 成体干细胞是一种尚未终末分化的、处于干细胞/祖细胞或前体细胞状态的成体细胞；正常生理条件下，倾向分化为所在特定组织的若干种细胞；

3、外界条件诱导下，成体干细胞能超越该特定组织，分化成其他的功能细胞，补充参与损伤组织的修复等。 三特征多能性 广泛性 迁移性 可调控性 增生活跃组织（如黏膜、骨髓）不活跃组组织（如神经脂肪、肺部）。 体内发生转分化的中介环节。Blau等将干细胞借助于循环穿梭于组织的特性成为“干细胞高速公路”。 高度依赖于干细胞所处的三维空间结构和多维的分化信号。微环境中的细胞因子、同种或异种细胞之间的接触、细胞外基质成分等对成体细胞的分化方向与进程起到重要的调控作用。 成体干细胞分化的可塑性 目前对于可塑性的机制有几种假说: 假说1 成熟的组织内的确存在由胚胎时残留下来的多能干细胞。 Verfaillie等证实

4、在成体许多组织中余存着一种稀有数量的胚胎样原始干细胞，表达胚胎干细胞的遗传标志，体外的培养条件也基本类似于胚胎干细胞。 假说2 可塑性是细胞融合的结果。 20世纪初期，通过细胞融合产生杂合体而改变细胞命运，例如将肌母细胞与纤维母细胞融合后，可在纤维母细胞内观察到肌蛋白表达； 将鼠骨髓细胞或神经细胞与胚胎干细胞共同培养后，骨髓细胞和神经细胞会产生明显的逆向分化，获得胚胎干细胞特征； 最近有研究人员将热休克的小气道上皮细胞与骨髓间质干细胞共同培养，观察到间质干细胞与损伤的气道细胞融合新生出气道上皮，而且融合率大于1%，推测在体内出现急性器官衰竭和组织坏死时有可能通过细胞融合完成组织修复. 假说3

5、细胞由成熟状态去分化为较原始状态，随后再分化为成熟的其他类型细胞，“克隆羊多利”明确显示细胞的遗传信息可以被再程序化，体细胞可以去分化成为多能干细胞. 低等脊椎动物的研究，显示损伤部位可以出现与胚胎发育类似的未分化细胞进行修复，嵘螺的研究表明其通过局部已分化终末细胞去分化完成修复功能. 分化就是受精卵发育成成体的过程中，细胞完成结构功能定向改变的过程，实质是基因选择性表达的结果。 去分化就是脱分化，分化细胞失去其特有结构而变成具有未分化细胞特征的过程。在动物中, 去分化细胞具有胚胎间质细胞的功能。在植物中, 去分化细胞成为薄壁细胞, 称为愈伤组织(callus)。去分化往往随之又发生再分化(r

6、edifferentiation)。 1、骨髓干细胞 2、神经干细胞 4、骨骼肌干细胞 3、肝干细胞 1、骨髓干细胞 骨髓由不同类型多种细胞成分组成的组织，除了分化的血细胞和间质细胞等，还存在两类成体干细胞： 一类是造血干细胞（hematopoietic stem cell,HSC）,能生成各种血细胞； 另一类是间质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC），能生成内皮细胞、脂肪细胞和成纤维细胞等。 体外培养的骨髓细胞，HSC细胞呈悬浮集落生长，而MSC细胞则贴壁生长，通过换液很容易把两者分开。 间质干细胞 证明可分化为包括骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞等，也能分化成内

7、皮细胞和内胚层的肝细胞。 当MSC细胞移植入小剂量射线照射的宿主，则造血系统和胃肠道组织有所增多，表明MSC细胞在异常环境中，细胞分化的可塑性增加。 造血干细胞 HSC移植至不同的体内微环境，可分化为3个胚层的各种类型细胞，包括心肌、骨骼肌、血管内皮系统、肝细胞、肺泡、食道、肠道、胃、胆管以及皮肤和神经细胞等。 HSC细胞在体外培养时，发现血细胞系之间，即淋巴细胞系与髓性细胞系之间和系内也存在分化方向的转变。 Hematopoiesis 造血Hematopoietic stem cellCommon lymphoid progenitor （淋巴系）Common myeloid progeni

8、tor （髓系）NK cellB cellT cellGran/Mac progenitorErythro/Plt progenitorRBCPlateletmacrophageneutrophilbasophileosinophil2、神经干细胞 神经系统中一类能自我更新，并产生神经元和神经胶质细胞的前体细胞。 主要存在于中枢神经系统的两个神经发生区域：脑的海马区和次脑室区，以及包括脊髓等其他非神经性的区域。 通过个体发育不同阶段的神经干细胞移植至宿主不同部位，发现神经干细胞移植分化为神经细胞的潜能具有发育阶段的依赖性，说明成体中的神经干细胞分化潜能受到一定的限制。 1999年，Bjorns

9、on将从成年小鼠脑组织分离的神经干细胞移植入经X射线照射过的小鼠骨髓部位，分化出血液细胞，开创了成体干细胞跨越组织或胚层分化研究的先例。 3、肝干细胞 对肝干细胞存在与否的问题一直有争论。 对发育中的肝脏具有自我更新能力的细胞进行单克隆培养和分析，证明其内的卵圆形细胞在体外能大量增殖，细胞移植后可分化，表明肝卵圆形细胞是肝干细胞，具有分化为肝细胞和胆管上皮细胞的双潜能性。 肝干细胞的鉴定 肝干细胞本身缺乏特异性标志，分离和鉴定带来了困难。 双潜能的肝干细胞同时表达肝细胞和胆上皮细胞的标志物，细胞角蛋白CK7和CK19为胆上皮细胞的特异性标志； 白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)和肝代谢酶细胞

10、色素P450可 作特异性标志物； 细胞角蛋白CK8和CK18在肝实质细胞和胆上皮细胞都有表达。肝干细胞一般除了其特有的形态学外，常结合上述特有标志，通过免疫组织化学、流式细胞检测和原位杂交等方法予以鉴定。 肝干细胞的可塑性 双潜能卵圆形细胞不仅能分化为肝细胞和胆上皮细胞，当分别移植到胰腺和十二指肠时，还能跨组织分化为胰腺细胞和肠上皮细胞，表明肝干细胞在适当的微环境中能被诱导分化为内胚层的其他组织细胞，目前，还未见有跨胚层分化的直接例证。 卵圆形细胞异常分化或分化突然停止有可能发生肝细胞癌。 4、骨骼肌干细胞 肌肉的生长、更新和修复是由卫星细胞（satellite cells）介导的，一般认为这

11、就是骨骼肌干细胞。 近年的研究表明，从肌肉分离的干细胞不仅能分化出肌肉，还能产生血液细胞成分。 骨骼肌干细胞不仅存在于骨骼肌组织，而且具有分化的可塑性，甚至跨越胚层分化为肝细胞和神经细胞。 成体干细胞的体外培养和特性 骨髓间质干细胞 造血干细胞 神经干细胞 1、骨髓间质干细胞 （MSC） 近年的研究已表明间质干细胞（MSC）能向软骨、骨、脂肪、造血基质和神经元样等细胞分化，使其首选为组织工程中的种子细胞。 最初，用含血清的完全培养基或无血清化学限定性培养液使孵化日龄鸡胚肢芽的骨髓MSC原代培养获得成功。 随后，大鼠、人和兔的骨髓MSC原代和继代培养也有进展。 大鼠骨髓MSC细胞体外培养 取大鼠

12、股骨，Tyrodes液洗涤干净 用注射器吸10ml含血清的DMEMLG培养液，将针头插入除去骨骺后的股骨一端的骨髓腔，注入培养液 从骨的另一端收集，反复抽吸，打散成细胞悬液调节有核细胞密度至5107个/ml，接种到直径为10mm的培养皿中 37,5%CO2 每隔34天换液一次，一般经2周左右可形成一些较大的细胞克隆 体外生长特性 原代培养物中多为成纤维样细胞，红细胞在此培养液中不能存活，而且不贴壁，通过换液而洗除。 MSC中混杂的巨噬细胞、单核细胞，造血细胞等，由于它们的贴壁黏附能力不同，通过调整胰蛋白酶EDTA的消化时间，保证在短暂消化时间内，使MSC与培养皿底脱离，而其他细胞仍贴附于培养皿

13、底，从而使MSC在传代期间进一步得到纯化。 MSC生长呈长梭形，成索密集排列。 鉴定包括人在内的MSC的直接标志物SH2、SH3、CD44、CD71、CD94、CD124、CD14、CD34等。 还可通过检测它们成骨和成软骨能力予以鉴定。 2、造血干细胞 胚胎发育中最早出现造血功能的组织是卵黄囊。 胎儿出生前，胚胎肝脏是主要的造血组织，内含较多的造血干细胞，人胚发育至6个月后，骨髓组织造血功能逐渐明显，而肝脏的造血功能逐渐减少。 出生后，造血细胞主要存在于红髓内。 红髓：脾脏白髓周围的区域，包括脾索和脾窦，脾索含大量B细胞、浆细胞、巨噬细胞和树突状细胞，由脾索围成的脾窦内充满血液。脾索和脾窦壁

14、的巨噬细胞能吞噬和清除血液中衰老红细胞和病原体。 脾脏内部可分为红髓及白髓。红髓的主要功能是过 滤和储存血液，由脾索及血窦组成，但因为其不含输入淋巴管，所以脾脏不能过滤淋巴的功能。而白髓的主要功能则为对抗外来微生物及感染。 在正常状态下一般摸不到脾脏，如果仰卧或右侧卧位可能触摸到脾脏边缘即可认为是脾大，近年来B超在临床的广泛应用： 引起脾大的原因有： （1）感染性脾大。各种急、慢性感染如伤寒、副伤寒、黑热病、血吸虫病、疟疾、病毒性肝炎、败血症、晚期梅毒等. （2）郁血性脾肿大。斑替氏综合征、肝硬化、慢性心力衰竭致心原性肝硬化、慢性缩窄性心包炎、门静脉或脾静脉血栓形成。 （3）增生性脾大。见于某

15、些血液病如白血病、溶血性贫血、恶性淋巴瘤等。 （4）其它。脾脏恶性肿瘤较罕见、脾脏囊肿、播散性红斑狼疮、皮肌炎、结节性多动脉炎、高雪氏病等。 因脾脏大原因较复杂，除少数人为生理性外，都应在医生指导下寻找病因，并要定期复查。 3、神经干细胞 神经干细胞体外培养和建系，必须满足两个基本条件： 具有永生化特性即在细胞周期内不断地复制增殖，产生大量子代细胞； 具有神经干细胞世系遗传显性特性 即神经干细胞表型，在适当的环境和条件下，它可分化为神经元和包括星形细胞、少突胶质细胞及Schwanns细胞等在内的神经胶质细胞。 体外培养建系 早期胚胎的神经管和神经嵴或胎儿的脑组织是体外培养神经干细胞的最理想材料

16、来源。 首要问题是维持其分裂、增殖的能力。 基本培养基是一种特定的N2液。添加因子有葡萄糖、人胰岛素、人转铁蛋白、黄体酮、二氢氯丁二胺、硒酸钠、谷氨酰胺和肝素等。 细胞传代时，用手术刀片沿着神经球中间的纵横轴切割成四等份，则神经干细胞可维持稳定而快速的生长。 生物学特性 未分化的神经干细胞一般每隔710天细胞数可增加一倍，一般可传35代，历时一年，在这期间，细胞系可分化为神经元、少突神经胶质细胞和星形细胞等多能性。 成体干细胞研究中的问题 限制成体干细胞应用的主要因素是来源困难 成体干细胞在体外传代中端粒酶活性很快下降，可能是造成成体干细胞不能在体外大量扩增的主要原因. 1、异质性 2、干细胞

17、所处环境 3、可塑性的调控 4、分化细胞的功能 5、体外增殖 1、异质性（heterogeneity） 指由于不同遗传机制而产生相同或类似的表现型。异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。 成体干细胞的可塑性是否与干细胞异质性直接相关？一种干细胞与其组织来源及归宿之间的确切关系？等，还需要深入的研究。 2、干细胞所处环境 环境的信号对干细胞的分化命运有着重要影响。 如，小鼠造血干细胞和胰腺干细胞都能分化出肝细胞，并能修复小鼠受损的肝组织，但，移植造血干细胞和胰腺干细胞对修复小鼠受损的肝组织的效果远远比移植成熟肝干细胞本身差得多。 干细胞在接受亚致死剂量照射等异常环境下被观察到“可塑性”现象，人们

18、还难以解释。 3、可塑性调控 外源性内源性体液因子、同种或异种细胞的接触、细胞外基质等的作用大多数干细胞的可塑性研究是基于组织损伤而造成的微环境一般认为转录因子在其中起着重要的作用。尚在起步阶段成体干细胞“可塑性”调控的解释(4种)： 机体中存在着多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体，能定向地向各自的组织来源的细胞分化； 机体中存在着一种多潜能的成体干细胞，在不同的微环境信号刺激下，可向不同组织的细胞方向分化； 特定组织来源的成体干细胞，除了向该组织的细胞分化外，在特殊信号的刺激下，可重新编程，继续分化为其他类型的细胞； 某种成体干细胞与特定组织来源的干细胞发生融合，产生具有两种细胞的遗传物质且染色体数量也是正常细胞两倍的“杂交细胞”，因而获得了后者的分化潜能。 4、分化细胞的功能 检测终末分化细胞的特定蛋白或标志物的表达，很少检测终末分化细胞的功能，有些不同类型的细胞却具有相同的标志。 检测到某种标志就证明该细胞或组织具有正常功能持有质疑，特别是干细胞的异质性和类型以及环境的复杂性使得人们对体外培养的干细胞移植入体内能否发挥预期功能表示怀疑。