qPCR优化课件(PPT 46页)

1、qPCR的优化邓椋爻 技术支持广州昊洋贸易有限公司第1页，共46页。定量PCR发展大量的科研工作使用定量PCR，每年产生大量的文章以Real-time PCR为关键词在 NCBI Pubmed 检索结果第2页，共46页。目标序列分析二级结构分析温度梯度优化实验条件标准曲线验证第3页，共46页。CCL26 cDNA sequence目标基因：CCL26（人脐静脉内皮细胞HUVEC ）CTGGAATTGA GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTT

2、GCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACT

3、CC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC AT第4页，共46页。序列同源性分析(BLAST)Prior to designing primers, its a good idea to run a sequence homology analysi

4、s. (BLAST)This allows the identification of sequences that may co-amplify or interfere with our intended target.The data is freely available, so why not make use of it. 第5页，共46页。CTGGAATTGA GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTTGCAGCATCAT GAT

5、GGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACTCC GAAACAATTG

6、TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATCCL26 序列比对第6页，共46页。CTGGAATTGA GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAA

7、G GGCCTGATTTGCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGCT CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTT

8、TAC TGAAAACTCC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGACGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATCCL26 序列比对第7页，共46页。目标序列分析二级结构分析温度梯度优化实验条件标准曲线验证第8页，共46页。Amplicon Secondary StructuresBad

9、location for primers/mfold/applicationsGood location for primers55C65C第9页，共46页。Real case -二级结构的影响及引物位置1110Forward PrimerReverse Primer APrimer BReverse Primer B Primer B: h = 95.8 % Primer A: h = 66.3 %Primer A第10页，共46页。Designs Primers - singleplex assaysDesigns Internal OligosProvides multiple outp

10、utsFree Web software provided by Steve Rozen and Whitehead Institute for Biomedical Research. /cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiPrimer Design 第11页，共46页。CTGGAATTGA GGCTGAGCCA AAGACCCCAG GGCCGTCTCA GTCTCATAAAAGGGGATCAG GCAGGAGGAG TTTGGGAGAA ACCTGAGAAG GGCCTGATTTGCAGCATCAT GATGGGCCTC TCCTTGGCCT CTGCTGTGC

11、T CCTGGCCTCCCTCCTGAGTC TCCACCTTGG AACTGCCACA CGTGGGAGTG ACATATCCAAGACCTGCTGC TTCCAATACA GCCACAAGCC CCTTCCCTGG ACCTGGGTGCGAAGCTATGA ATTCACCAGT AACAGCTGCT CCCAGCGGGC TGTGATATTCACTACCAAAA GAGGCAAGAA AGTCTGTACC CATCCAAGGA AAAAATGGGTGCAAAAATAC ATTTCTTTAC TGAAAACTCC GAAACAATTG TGACTCAGCTGAATTTTCAT CCGAGGA

12、CGC TTGGACCCCG CTCTTGGCTC TGCAGCCCTCTGGGGAGCCT GCGGAATCTT TTCTGAAGGC TACATGGACC CGCTGGGGAGGAGAGGGTGT TTCCTCCCAG AGTTACTTTA ATAAAGGTTG TTCATAGAGTTGACTTGTTC ATCCL26 primer design第12页，共46页。How did they fare?CCl26 amplified using Bio-Rad SsoFastTM EVAGreen Supermix: 5ul Assay 98oC 30sec / 50 x 95oC 1 se

13、c 55-70oC 5 sec / melt analysis第13页，共46页。目标序列分析二级结构分析温度梯度优化实验条件标准曲线验证第14页，共46页。检测特异性：熔解曲线、琼脂糖凝胶电泳、酶切、测序 借助温度梯度优化实验条件并验证实验体系 最合适的退火温度高特异性、高产率 发现并消除引物二聚体的潜在威胁 发现并消除扩增子二级结构的潜在威胁 降低引物浓度差异的潜在威胁 利用标准曲线检验验证下列因素 扩增效率 标准品的动态范围 PCR抑制剂的存在与影响用SYRB Green进行体系的优化与验证第15页，共46页。特异性 样本熔解曲线倒数图中有单一清晰的峰 阴性对照中无扩增产物 同时进行凝胶

14、电泳实验检测特异性第16页，共46页。dynamic thermal gradient6oC Below10oC Above利用温度梯度优化体系第17页，共46页。 Thermal gradientSingle Plate Optimisation of Annealing Temperature and PCR Efficiency via Slope of Calibration Curve 一次试验完成引物退火温度和扩增效率的优化利用温度梯度优化体系Dilution series107106105104103102一对引物在每一个温度下，做一个模板稀释序列 (每个稀释两个重复），引物浓度

15、固定。第18页，共46页。利用温度梯度优化体系检查特异性第19页，共46页。Tm=68oCE=40%R2=0.977Tm=67oCE=69%R2=0.999利用温度梯度优化退火温度Early Ct Reproducibility 第20页，共46页。Tm=65.5oCE=93%R2=1.000Tm=64oCE=103%R2=0.999利用温度梯度优化退火温度第21页，共46页。Tm=62oCE=103%R2=0.999Tm=61oCE=103%R2=0.999利用温度梯度优化体系第22页，共46页。Optimal ConditionsTA = 61 - 64CE=103%R2=0.999利用温

16、度梯度优化体系第23页，共46页。dynamic thermal gradient6oC Below10oC Above利用温度梯度优化退火温度 - 简易法（节约试剂）第24页，共46页。最佳退火温度的选择第25页，共46页。最佳退火温度的选择第26页，共46页。最佳退火温度的选择第27页，共46页。最佳退火温度的选择第28页，共46页。最佳退火温度的选择第29页，共46页。最佳退火温度的选择第30页，共46页。最佳退火温度的选择第31页，共46页。最佳退火温度的选择第32页，共46页。最佳退火温度的选择第33页，共46页。最佳退火温度的选择第34页，共46页。Optimal annealin

17、g temperature最佳退火温度的选择第35页，共46页。100nM each primer引物浓度的优化第36页，共46页。200nM each primer引物浓度的优化第37页，共46页。400nM each primer引物浓度的优化第38页，共46页。800nM each primer引物浓度的优化第39页，共46页。400nM primer at 60o800nM primer at 60o200nM primer at 60o100nM primer at 60o100nM primer at 55o200nM primer at 55o400nM primer at 55o800nM primer at 55o引物浓度 vs.退火温度如果退火温度优化得合适，引物浓度对Cq的影响会降到最低第40页，共46页。目标序列分析二级结构分析温度梯度优化实验条件标准曲线验证第41页，共46页。 使用SYBR Gree