基因克隆和表达的载体课件

1、*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 1课程要求通过本课程的学习，掌握基因工程的一些基本原理和基本操作技术等。 总成绩平时（20）实验（30）考试（50） 平时成绩(考查迟到、早退，课堂提问、讨论、遵守课堂纪律等方面)*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 2教材和参考文献楼士林等，基因工程，科学出版社，2002吴乃虎，基因工程原理（第二版上、下册），科学出版社，1998张惠展编著，1999年出版，基因工程概论，华东理工大学出版社。Watson, J .D et al. Recombinant DNA, W. H. Freeman and Company, New Yor

2、k, 2ed, 1992Robert F. Weaver, Molecular Biology, 科学出版社, 2000（影印版）*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 3本课程内容第一章 绪论第二章 基因克隆的工具酶第三章 基因工程的载体第四章 目的基因的制备第五章 目的基因导入和重组子的筛选第六章 外源基因的表达第七章 基因操作的基本技术第八章 植物基因工程及应用第九章 动物基因工程及应用第十章 医学基因工程及应用*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 4第三章 基因工程的载体3.1 载体的功能及其特征3.2 质粒克隆载体3.3 病毒（噬菌体）克隆载体3.4 酵母载体3

3、.5 人工染色体克隆载体*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 53.1 载体的功能及其特征载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。载体：指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。载体的功能:1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 作为工程载体必备的条件具有多个单一的限制性内切酶酶切位点有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。具有筛选转化子的选择性标记基因安全

4、，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中。分子量小，拷贝数多。携带外源基因的幅度宽*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 6*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 7自主复制型载体和附加载体的扩增方式 载体的类型应用范围：克隆载体、表达载体。应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 8克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载

5、体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 9表达载体(expression vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 10穿梭载体(shuttle vector) 又称双功能载体(bifunctional vector)。能在两种不同的生物体内复制的载体。同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的病毒复制原点或酵母菌的自主复制序列(

6、ARS)，它即能在原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移，通常是将载体和待克隆的真核生物DNA片段先在细菌中克隆，再转移到真核细胞中表达，并可提高外源基因的表达效率。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 11病毒载体(virus vector)常用的动物病毒表达载体可分为两大类：整合型（integrated）载体: 即外源基因通过这种病毒载体与宿主细胞的染色体整合，外源基因随宿主细胞基因组的复制而扩增。这类载体的代表是 SV40PSV系列和逆转录病毒逆转录病毒表达载体pLPGHL、pMSV 等。游离型(transient)或称病毒颗粒型

7、载体: 这类载体携带外源基因后，本质上仍然是一种完整或缺损的病毒，能够以病毒颗粒的形式在宿主内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。这类载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒载体从构建来源分质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA组成的载体质粒DNA与染色体DNA片段组成的载体*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 133.2 质粒克隆载体3.2.1 质粒的生物学特性3.2.1.1 质粒DNA的复制3.2.1.2 质粒DNA的不亲和性或互不相容性3.2.1.3 质粒的转移和迁移性3.2.1.4 质粒的重组性3.2.1.5 显性质粒和隐性质粒3.2.2 质粒载体的构建3.2.2.

8、1 理想的质粒载体应具备的条件3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则3.2.2.3 常见质粒载体及其构建3.2.2.4 质粒载体的评价*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 14质粒（plasmid）指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，在某些蓝藻、真菌和绿藻细胞中也发现；在酵母、眼虫、衣藻等真核生物中也存在。绝大多数为环状双链DNA分子；极少数为线性质粒和RNA质粒。环状双链质粒DNA的三种构型： 超螺旋(SC)/共价闭合环形(cccDNA, covalently closed circular DNA)；开环(oc-DNA, open c

9、ircular DNA)；线性(L-DNA, linear DNA)*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 15*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 16*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 173.2.1 质粒的生物学特性（一）自主复制性质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。不同的质粒在宿主细胞内的拷贝数也不同，少则几个多则几百个不等，当然由于质粒上并没有复制酶的基因，所以其复制需要使用宿主细胞复制染色体DNA的多种酶群。（二）不相容性利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RN

10、AII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快，结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 18（三）可扩增性质粒就其复制方式而言分为两类：松弛型复制及严谨型复制。pMB1或ColEI类质粒复制子的复制完全依靠宿主细胞提供的半衰期较长的复制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的产物），因此在蛋白质合

11、成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做氯霉素扩增。但另外两种质粒（psc101和p15A）的复制子的复制受质粒上编码的蛋白因子的正调节。氯霉素抑制蛋白质合成后，这类质粒便不能持续复制。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 19（四）可转移性在天然条件下，很多天然质粒都可以通过细菌接合作用从一种宿主细胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依赖于质粒上的tra基因产物。3.2.1.1 质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制

12、质粒： （1）复制起点 （2）控制质粒DNA复制强度的有关基因： cop: 指令宿主细胞合成阻遏物，阻遏物的累积阻止质粒的继续复制。 rep:指令宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制。 par序列: 该序列附着在细胞膜上，使质粒分子在细胞分裂时正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 20松弛型和严谨型质粒拷贝数（copies）：指一个宿主细胞内某种质粒的数量与宿主染色体数量（通常为一条染色体）之比。严谨型质粒(stringent plasmid) :拷贝数为1至几个的质粒。松弛型质粒(relaxed plasmid) :拷贝数多于10个

13、的质粒。严谨或松弛与质粒的大小及宿主类型有关。含松弛型质粒的细菌在含氯霉素的培养基中培养时，可使质粒大量扩增。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 213.2.1.2 质粒DNA的不亲和性或互不相容性（incompatibility）指在无选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。亲和性质粒：指能同寓于一细胞中的不同质粒。不亲和性质粒：指不能同寓于一细胞中的不同质粒。一般为亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 22*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 23质粒不亲和性的

14、机制受相同阻遏物的制约在细胞膜上有相同的结合位点3.2.1.3 质粒的转移和迁移接合质粒(conjugative plasmid)：指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒DNA从供体细胞转移至受体细胞。如：质粒上的tra基因使宿主细胞（大肠杆菌）产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合。分子较大、拷贝数少、宿主广、自行接合转移、较不安全。如：F质粒、Ti质粒等。非接合质粒(non-conjugative plasmid)：分子小、拷贝数多、不会自行接合转移，安全。如：ColE1质粒等。基因工程中选用*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 24迁移作用

15、(mobilization)指在接合质粒的共存下引发的非接合质粒的转移特性。由 mob和bom两个基因控制基因工程常利用mob和bom基因缺陷型（mob, bom ）的质粒和菌株*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 253.2.1.4 质粒的重组性由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。在基因工程应用的是重组缺陷型（rec）的质粒和菌株。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 263.2.1.5 显性质粒和隐性质粒显性质粒（表达型质粒）：指携带除与自身复制和转移相关的基因，还携带一些使宿主细胞呈现新性状基因的质粒。如： 抗抗菌素的抗性质粒（R质粒）；产大肠杆菌素（c

16、olicins）的Col质粒；引起细胞接合的育性质粒（F质粒）；降解金属有机物、芳香烃和农药等毒物降解的降解质粒；及致植物形成冠瘿瘤的Ti质粒。隐性质粒：宿主含有某种质粒，但无异样的性状表现出来，这样的质粒称隐性质粒。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 27*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 28根据质粒基因编码的特性将质粒分为五大类Fertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移外没有其他功能。Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，发现于假单胞杆菌。Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存在于E. co

17、li 中的CoE1。降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水杨酸。致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 29利用抗性基因进行重组子的筛选*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 303.2.2 质粒载体的构建3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件3.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则3.2.2.3 常见质粒载体及其构建3.2.2.4 质粒载体的评价*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 31引序（一）天然存在的两种质粒（1）colE1宿主细菌大肠杆菌

18、6.5kb松弛型复制20-30/cell（2）pSC101宿主细菌沙门氏菌8.8kb严谨型复制5copy/cell标记基因为Tcr质粒的命名 p小写代表质粒；后面有两至三个大写字母代表发现者或构建者的姓名。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 32（二） 质粒人工构建的目的天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：（1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组（3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量（4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝（5）根据基因工程的特殊要求

19、加装特殊的基因元件 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。3.2.2.1 理想的质粒载体应具备的条件分子量较小。 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有一个强的选择标记。具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。能够导入寄主细胞，具备转化的功能。操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质粒载体。天然质粒载体的局限性： 天然的质粒不能具备以上所有条件，所以实际应用的都是人工构建的质粒。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 333.2.2.2 构建质粒载体应遵循的原则选用合适

20、的出发质粒正确获得构建质粒克隆载体的元件根据要转化的受体细胞的特性，组装合适的选择标记基因。构建质粒表达载体，选用合适的启动子。力求构建过程简单化*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 343.2.2.3 常见质粒载体及其构建人工构建的质粒根据其功能及用途分为:1.多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。2.测序质粒3.整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 3

21、5*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 365.表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达6.探针质粒 筛选克隆或寻找基因元件，通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等(下图)。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 37实验室常用质粒：1. pBR322质粒载体的构建：出发质粒： pMB1:类似松弛型ColE1质粒 pSF2124:含Ampr基因 pSC101:含Tcr基因*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 38*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 39pB

22、R322质粒载体的优缺点优点：分子量小：4363bp, 容易纯化。含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA，amp基因内可被Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到15个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素，可达到1000-3000拷贝，cpoies。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 40缺点：有被动迁移的可能，不够安全。抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比

23、较麻烦。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 41pBR322质粒载体*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 422. pBR327：一个多拷贝质粒pBR327是在pBR322的基础上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改变了质粒的复制和接合能力。他与pBR322这要有两点不同：1） pBR327比pBR322有更高的拷贝，每个细胞中含有30-45个拷贝。但正常细胞中较高的拷贝数，使它适合于应用于基因功能研究。2） 剪切破坏了pBR322的接合能力，pBR327不具有接合能力，不能直接转入其他细胞。这对生物biological containm

24、ent是非常重要的（生物防范）。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 43pBR327：一个多拷贝质粒*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 443. pUC8Lac 选择质粒pUC8也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC8的优点：1）突变位点位于复制起点，复制前可以使细胞中质粒的拷贝数达到500-700个，可以提高载体的产量。2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。3）pUC8的多克隆位点，可以使具

25、有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 45*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 464. pGEM3Z-DNA的体外转录pGEM3Z与pUC载体非常相似，不同的是pGEM3Z含有两段额外的短的DNA片段，每一段可以作为RNA聚合酶的识别位点。这两段启动子存在于限制性内切酶的两端，这意味着如果在重组的pGEM3Z载体中加入RNA聚合酶，可以发生转录，合成的RNA可以作为探

26、针使用，或者研究RNA的加工过程或者蛋白质的合成。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 47*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 48实验一 质粒的制备实验课上具体讲解3.2.2.4 质粒载体的评价操作简便克隆容量有限（ 10kb）*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 493.3 病毒（噬菌体）克隆载体3.3.1 噬菌体的生物学特性3.3.2 噬菌体载体3.3.3 柯斯载体3.3.4 M13单链丝状噬菌体载体*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 50噬菌体 (phage)感染细菌的病毒*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 513.3.

27、1 噬菌体的生物学特性具有对寄主的依赖性。利用寄主的蛋白合成和复制系统进行生长和繁殖。具有高感染性感染途径：溶菌生长；溶原生长*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 52噬菌体溶菌生长溶菌生长: 噬菌体感染宿主细胞后，大量增殖子代噬菌体颗粒，使宿主细胞裂解，释放出来的病毒颗粒又再感染其它细胞，这种周而复始的生命过程（生活周期）称溶菌生长。烈性噬菌体： 噬菌体感染宿主细胞后，DNA不整合到宿主染色体，只进行溶菌生长，这样的噬菌体称烈性噬菌体。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 53噬菌体溶原生长溶原生长：噬菌体感染细菌，DNA整合到寄主染色体中，随寄主细胞染色体的复制而复

28、制，寄主细胞仍然正常分裂，并不死亡，这种生命过程叫作溶原生长。温和噬菌体（temperate phage）：病毒感染宿主细胞后DNA整合到寄主染色体中，无感染其它细胞的能力，这样的病毒，称温和噬菌体。溶原性细菌（lysogen）：细菌染色体中整合有噬菌体基因组的细菌。对同种噬菌体具有免疫性。溶原化（lysogenization）：用温和噬菌体感染细菌使之成为溶原性细菌的过程。原噬菌体（prophage）：在溶原性细菌内存在的整合噬菌体DNA ，称原噬菌体。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 543.3.2 噬菌体载体3.3.2.1 噬菌体的性质3.3.2.2 噬菌体载体构建的原理

29、3.3.2.3 重组DNA分子的体外包装3.3.2.4 噬菌体载体的评价*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 553.3.2.1 噬菌体的性质野生型入噬菌体DNA为双链线性分子黏性末端(cohesive end)：线性分子左右两端各有12bp组成的5端突出的粘性末端，DNA进入宿主细胞后黏性末端连接形成环DNA分子。 cos位点(cohesive end site) ：指在连接酶的作用下，连接上述黏性末端结合形成的双链DNA区段。又称黏性末端位点。全长48,502 bp，约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。入噬菌体DNA分子上有56种限制性核

30、酸内切酶识别位点。温和噬菌体，易于在溶源生长保存，在溶菌生长增殖。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 56*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 57噬菌体的侵染循环*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 583.3.2.2 噬菌体载体构建的原理建立克隆载体前需要解决2个问题1） DNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。2） 基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因组。. 缩短长度 野生型DNA包装的上限为50.5kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.

31、4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 59DNA的结构 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 60策略：利用限制性内切酶切去入DNA上非必需区。采用点突变或甲基化酶处理，使入DNA上必需。区内多余的限制性内切酶识别位点失效在入DNA的非必需区内组入选择性标记基因建立重组入DNA分子体外包装体系*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 62. 缩短长度:入噬菌体载体的 类型 插入型载体(insertion v

32、ector)该类载体经改造后的长度为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为13.9kb（54.9-37kb）。由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-13.9kb）gt10，可以携带8kb的DNA分子，插入位于阻遏基因cI内的单一的酶切位点EcoR I。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。ZAPII，含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约10kb的新的DNA分子，通过lacZ基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 63插入型载体*欢迎02级农业生物技术

33、班同学们听课！Slide 64. 缩短长度:入噬菌体载体的 类型 替换型载体(replacement vector) 该类载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。显而易见，这类载体的容量不仅比插入型载体大，而且有一个下限：40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。这类载体实际上已经不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中

34、去，当然这类载体的使用较为繁琐，现在商品化了的取代型载体已去除了中间片段（14kb）解决了这一问题。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 65WES. B，两个 EcoR I位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。EMBL4，可以插入20kb的DNA分子，可利用EcoR I、BamH I、Sal I替换填充片段，因此可以插入不同粘端的DNA片断。重组子的筛选可以根据片段的大小也可以利用Spi表现型。(课外资料)EMBL3和EMBL4是常用的基因组克隆载体，克隆外源片段的大小为9-23kb。两载体均在填充片段内含有red及gam基因。red及gam基因使噬菌体无法在一些宿主菌中生长

35、，这些宿主菌是非类似噬菌体P2的溶源菌株（比如，这些菌株在基因组内有P2基因组的一个拷贝。当填充片段被外源片段取代时，重组菌株成为red-及gam-，能在P2的溶源菌株中生长。这一现象称为spi-筛选（对P2介入敏感）；spi-筛选不利于亲代载体，可降低非重组子的数目。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 66取代型载体*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 67.修饰酶切识别位点天然的-DNA上有多个酶切位点，如：EcoR I 5个，Hind III 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的品系。自然选择法可以利用一个产生EcoR I的

36、大肠杆菌，大部分侵入细胞的 DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoR I位点缺失了。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 68通过自然选择法筛选无EcoR I识别位点*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 69-DNA的抽提1) 大肠杆菌培养至对数生长期（在含有乳糖的培养基中）2) 加入-噬菌体或重组噬菌体悬浮液，37培养1小时3) 用新鲜培养稀释，继续培养4-12小时4) 高速离心，沉淀噬菌体5) 苯酚抽提，释放-DNA6) 乙醇或异丙醇沉淀DNA3.3.2.3 重组DNA分子的体外包装入噬菌体DNA必须进行体外包装，才能成为有活性

37、的病毒颗粒。入噬菌体的包装容量为野生型入噬菌体DNA（48 kb）的75105，即约36.451kb.从入噬菌体突变株感染的溶原菌株，提取噬菌体包装所需的全部蛋白质。2005年8月11日6时44分欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 703.3.2.4 噬菌体载体的评价-DNA作为载体的优点1) -DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌2) -DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量3) 重组-DNA的筛选较为方便, 可进行正向筛选和杂交筛选。4) 重组-DNA分子的提取比质粒容易操作较复杂*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 7

38、13.3.3 柯斯质粒载体或称粘粒(cosmid)cosmid: cos site-carrying plasmid杂种质粒是一类人工构建的含有入DNA cos 位点、噬菌体包装有关的DNA短序列（具有噬菌体的高感染性）、质粒DNA复制子、抗生素标记基因等元件的特殊质粒载体。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 72*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 73（一）考斯质粒的构建 -DNA载体的最大装载量为25kb,有的往往需要构建克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒就是应这种需要而人工组建的。考斯质粒顾名思

39、义就是含有-DNA两端cos区的质粒。由于-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，考斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 74Cos质粒pJB8（二）Cosmid载体的特点为双链环状DNA分子。分子小，约46kb，可容纳大40kb的外源DNA片段。适用于构建真核细胞的基因

40、组文库。具有质粒的特性，可以转化大肠杆菌，并按质粒的复制方式进行复制和增殖。具有噬菌体的特性，在体外进行包装后，可高效转导大肠杆菌，但不能进入溶菌和溶原生长，不能产生子代噬菌体。含有抗药性基因，可进行插入失活筛选。由于非重组体很小，不能在体外包装, 因此非重组体的本底很低，利于重组克隆的筛选。由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 763.3.4 M13单链丝状噬菌体载体（一） M13单链噬菌体的分子生物学：M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然

41、后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。单链DNA利用宿主细胞复制另一条链（负链），形成双链DNA（RFDNA），然后以负链为模板，滚筒式复制串联式上链分子，当拷贝数达到100-200时，负链上的基于产物干扰复制，使其停止，同时，由两条链上编码的蛋白基因表达，包装正链，并分泌至体外，宿主细胞不会发生裂解。细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 77M13噬菌体的侵染循环 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 78（二） M13-DNA载体家族1. M13mp载体家族M13-DNA上几乎没有非必需区域，因而载体的构建主要是

42、插入标记基因如，lacZ、多克隆位点，消除多余的酶切位点。在M13上引入lacZ基因，产生了M13mp1，这样就可以通过插入失活鉴定重组噬菌斑。M13mp1载体不含有任何的单一切点的的识别序列，在基因的起始端，含有6碱基的序列GCATTC，是一个EcoR I位点，这是通过体外定点突变获得的，产生了M13mp2。M13mp2*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 79 是最简单的M13克隆载体，具有EcoR I粘端的DNA片段可以插入克隆位点，在X-gal培养基上可以很容易的区别出来。M13载体的构建的第二步是将限制性内切酶位点引入lacZ基因，这一步是通过合成短的多聚核苷酸称为pol

43、ylinker，含有一系列的限制性位点和EcoR I粘端，完成的。多聚接头插入到M13mp2的EcoR I位点上，就产生了M13mp7。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 80外源基因由M13mp8向M13mp9载体的转*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 812. 噬菌粒（Phagemid）质粒与M13-DNA的重组体，它带有质粒上的酶切位点及标记基因，这样便于筛选及克隆，同时由于不含包装蛋白基因，载体本身长度减少，装载量增大，比质粒大，但不及-DNA。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 82pEMBL8的结构*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Sl

44、ide 83将pEMBL8转化为单链形式 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 84（三） M13-DNA作为载体的优点及用途最为显著的优点是它能使插入的外源DNA片段变成单链，用途：（1）用于双脱氧末端终止测定DNA顺序（2）用于单链DNA的定点诱变（3）用于合成探针*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 853.4 酵母载体酵母是生物技术中最重要的生物体之一，除了酿酒和生产面包外，也被用来作为基因克隆的受体生产药物。在酵母S. cerevisiae的大部分品系中都发现了质粒的存在，它是一个2um环状的分子。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 86(一)

45、2um质粒的选择标记2um质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1, REP2。2um质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用LEU氨酸作为选择标记，需要用到一种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide

46、 87leu-作为酵母载体的选择标记基因*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 88(二) 以2um质粒为基础的载体酵母附加质粒来自于2um质粒的载体称为酵母附加载体或者YEps。YEps可以含有完整的2um质粒，也可以只含有2um质粒的复制起点，如YEp13以后的类型。YEp13是一个穿梭质粒，含有2um质粒的复制起点和选择基因LEU2, YEp13还包含pBR322的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。操作步骤：首先要在大肠杆菌中进行克隆试验，选择重组子，重组质粒纯化后转化酵母。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 89YEp的结构*欢迎02级农业生

47、物技术班同学们听课！Slide 90（三） YEp可以插入酵母的染色体DNA附加体意味着YEp可以独立的复制也可以整合到酵母的染色体内，因为在载体中作为选择标记的基因与突变体主染色体DNA同源性很高，比如YEp13质粒中LEU2基因可以与染色体上突变的LEU2基因进行重组，将整个质粒插入到酵母染色体内，可以一直保持整合状态，随后的重组事件也可以切下来。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 91YEp整合到酵母染色体上*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 92(四) 其他类型的克隆载体除了YEps，还有其他类型的载体，下面介绍主要的两种：酵母整合质粒(YIps)：主要是细

48、菌质粒含有一个酵母基因。如YIp5，是在pBR322的基础上插入了一个URA3基因，这个基因编码乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶，是嘧啶合成中的一个酶，可以作为选择标记，选择的方法与LEU2标记相同，YIp不能像质粒一样复制，其复制依赖于整合到酵母的染色体上，整合的机制与YEp相同 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 93酵母复制质粒(YRps)：由于含有一段包括起始位点在内的染色体DNA, 可以作为独立质粒进行复制。复制起始位点与多个酵母基因距离很近，包括作为选择标记的基因。YRp7是其中的一种，他由pBR322与酵母基因TRP1组成，TRP1参与色氨酸的合成，他与起始位点的距离非常

49、近，插入YRp7的酵母DNA片段包括TRP1和复制起始位点。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 94整合型载体 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 95在一个特定的克隆实验中选用哪一种类型的质粒需要考虑三个因素转化频率，也就是每ug的质粒DNA可以获得转化子的数目。YEps的转化频率最高，每ugDNA可以获得10000-100000个转化细胞，YRps次之，可以产生1000-10000个转化细胞，YIp产量较低，一般少于1000个，如果不是用特殊的程序，只能产生1-10个重组子，较低的转化效率意味着与染色体之间的重组是非常少的。拷贝数：YEps和YRps含有的拷贝数

50、也最多，每个细胞中含有20-50和5-100个，而YIps一般只以单个拷贝*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 96存在于细胞中。如果要从克隆的基因中获得蛋白，这些特性就非常重要，因为拷贝数越多，蛋白质的产量就越高。稳定性：因为YIps能产生稳定的重组子。另一方面YRp重组子是非常不稳定的，母细胞中聚集大量的重组分子，但在子代中就可能丢失，YEp也有同样的问题。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 97复制型酵母载体*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 983.5 人工染色体克隆载体自Cohen 等( 1973 ) 构建第一个质粒载体pSC101 作克隆载

51、体以来,随着分子生物学技术的发展,越来越多的克隆载体相继出现,这些载体的发展推动了结构基因组学和功能基因组学研究。同时随着人类基因组计划和植物基因组计划的实施,克隆载体的整体结构、克隆能力和转化效率等都有了长足的发展。可以把克隆载体的发展划分为三个阶段:第一阶段以质粒( plasmid)、噬菌体(bacteriophage)、柯斯质粒(cosmid, 又称粘粒) 为主, 主要特点是载体在宿主细胞内稳定遗传、*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 99易分离、转化效率高,但是克隆容量有限,一般小于45kb。第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量,显著特点是载体的容载能力扩大,约,主要有

52、酵母人工染色体(yeast100350kb artificial chromosome,YAC) 、细菌人工染色体( bacterial artificialchromosome, BAC) 以及源于噬菌体P1 的人工染色体(Pl-derived artificial chromosome, PAC) 。第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元细菌人工染色体(binary BAC, BIBAC) 和*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 100可转化人工染色体( transformation competent artificial Chromosome, TAC), 这些载体不仅具有

53、较大的克隆容量, 而且具备了直接转化植物进行功能互补实验的功能。几种克隆载体性质的比较见表。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 101*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 102YAC载体的结构和应用真正的人工染色体要在寄主细胞中稳定地复制并遗传下去, 必须具备三个元件: 复制起始区(origin of replication), 参与染色体DNA复制起始结构的形成; 着丝粒(centromere)，负责染色体向子细胞的传递; 端粒(telomere), 对染色体DNA两个末端起封口和保护作用。Murray 等(1983) 利用这三个元件构建了第一个酵母人工染色体。

54、 pYAC3是在pBR322的基础上，插入了几个酵母基因。其中两个基因是URA3和TRP1，可以作为选择标记分别存在于YIp5, YRp7，就像在YRp7中一样，携带TRP1的同时也包含一个复制起点，但在pYAC3中这一片段扩展到CEN4，他是一段来自4号染色体着丝粒的DNA片段。TRP1-originCEN4*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 103片段已经包含了人工染色体组成三部分中的两部分。第三部分端粒，有两段称为TEL的序列提供，并不是他们自身组成端粒序列，而是在引入酵母细胞核后，作为种子序列建立端粒。还有最后一部分没有提到的是SUP4，他在克隆实验中作为插入片段的选择标

55、记基因。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 104利用pYAC3克隆的策略如下：载体首先被BamH I和SnaB I酶切将分子切成三块，BamH I片段被去掉，剩下两个臂，每一臂都已TEL作为末端，另一端是SnaBI位点。克隆的DNA必须是平端(SnaBI也是一个平端酶，识别序列是TACGTA)被连接在两个臂的中间就产生了人工染色体。利用原生质转化法将人工染色体引入酵母。受体酵母是利用一个双营养缺陷体trp1-ura3，载体上含有互补基因作为选择标记。转化后于基本培养基上培养，只有含有人工染色体的细胞可以正常生长。含有两个左臂或者两个右臂的染色体都不能正常生长，因为其中一个选择标

56、记基因丢失，插入片段的鉴定可以通过SUP4基因的插入失活，白色的克隆是重组子，红色的不是。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 105利用YAC载体克隆外源基因*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 106YAC载体的使用一些哺乳动物的基因大于100kb（如人类膀胱纤维基因有250kb），超过了大肠杆菌载体系统的承受范围，但正好在YAC载体的范围之内。最近的研究发现，在某些情况下，YACs可以在哺乳动物中表达，因此可以在基因存在的生物中研究基因的功能。YACs在构建基因文库中非常重要，要知道，最高容量的大肠杆菌质粒可以插入300kb的片断，对于人的基因文库需要30000

57、个克隆，而YACs可以克隆600kb的片段，一些特殊的类型可以携带1400kb片段，可以是人类基因文库的克隆是降至6500个。但不幸的是，这样的“mega-YACs”存在着不稳定性，克隆的DNA片段可以被重新排列。不管怎样，YACs在大规模的测序中例如人类基因组计划是非常有用的。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 107YAC 载体的突出特点：是容载能力大, 如动物的YAC文库平均插入长度达9001000kb。植物YAC文库平均插入片段一般为100350kb, 其原因是植物细胞较大, 有硬而厚的细胞壁, 同时细胞内多糖和DNA 水解酶类多, 难以得到超大分子量的基因组DNA。由

58、于YAC 插入片段大,构建基因组文库时, 只需要较少的克隆数便可以覆盖整个基因组, 使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱成为可能, 基因组计划得以顺利实施。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 108虽然YAC 能容载较大的片段, 但是YAC 克隆的稳定性较差, 操作也不方便, 具有自身难以克服的缺点: 1) 存在嵌合现象(chimerism), 即一个YAC克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段, 嵌合体的比例达到10 %50 %, 这种现象使染色体步行(chromosome walking) 和基因分离难度加大; 2)YAC 克隆的稳定性差, 插入片段存在重排和丢失现象,

59、 这对染色体物理图谱的构建和基因分离都十分不利; 3) 插入片段的分离和纯化困难; 4) 转化效率低。 *欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 109细菌人工染色体(BAC)即 (bacterial artificial chromosome)载体最初是由Shizuya 等人 于1992年利用F因子的oriS 、repE、parA 和parB 等与复制和调节拷贝数有关的基因, 以氯霉素抗性基因为选择标记, 并利用电激穿孔转化大肠杆菌DH10B, 构建了第一个细菌人工染色体载体pBAC108L ,它能够克隆约300kb的外源片段, 但是它只有转化选择标记而无重组子选择标记, 重组子的选

60、择必需通过杂交进行验证。外来的DNA一旦被克隆到宿主细菌中，就会产生大量拷贝。已建成人和鼠BAC基因库。由于这些巨大的放到载体上的DNA片断可以在细菌里复制，被称为细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)，这种载体所构建的基因库又叫BAC基因库。*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 110*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 111*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 112*欢迎02级农业生物技术班同学们听课！Slide 113BAC 载体的容载能力一般为100350 kb, 虽然容量没有YAC 载体大,