第四章 胚胎(共15页)

1、第四章 胚胎，花药(huyo)和花粉培养胚胎(piti)培养：是指将种胚及其相关器官或组织（子房、胚珠、胚乳）进行离体培养，使其发育成完整(wnzhng)植株的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等 背景Hanning and Laibach 建立了合子胚培养技术20世纪20年代建立了幼胚培养和胚胎拯救技术1934 清华的李继侗和沈同发现银杏gingko胚乳提取物可刺激离体胚生长1940 La Rue 最先培养胚乳1941 Van Overbeek 发现椰乳对幼胚发育的促进作用之后胚胎培养技术逐渐成熟，1970 Bhojwani 白花寄生获得胚乳植株第一节 胚胎培养一

2、胚培养1. 胚培养的用途1)克服远缘杂种的不育性: 在高等植物的种间和属间杂交后代胚败育，胚发育不全而不能正常萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。2) 克服了种子休眠和种子自交(z jio)不育性，使胚发育不全的植物(zhw)获得后代。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。3）胚的拯救(zhngji)： 远交的种胚常因胚乳发育不良而败育，败育前培养可得植株；早熟、生活力低的种子亦然。 4) 缩短育种年限 在杂交育种中，应用胚培养技术可以缩短育种周期12年。5）获得单倍体植株远缘杂交结合胚培养，是获得单倍体的有效途径之一。6）诱导胚状

3、体用幼胚或其他胚胎组织进行培养，可获得大量胚性愈伤和胚状体。7）胚胎发育研究。8）种子生活力的快速测定：未后熟和经后熟的种胚在离体培养下萌发速率一致。用于休眠期长的植物。2、 内容：包括胚胎发育不同时期的胚，一般分为未成熟胚（子叶期前）和成熟胚（子叶期后）的培养。成熟胚培养较易，在含大量元素和糖的培养基上就能培养成苗。未成熟胚培养较难，需提供必需的营养和条件。3. 胚培养的技术3.1 成熟(chngsh)胚方法(fngf)：种子(zhng zi)表面消毒无菌水冲洗剥胚接种于简单培养基培养。培养条件：具休眠习性者，4 处理后转入常温培养25度；12 h左右光照。3.2 幼 胚方法：胚珠表面消毒解

4、剖镜下剥胚（带胚柄）接种培养。培养基：成熟胚对培养基要求不高，而幼胚要求较高，MS，B5，Nitsch培养基，其他适于未成熟胚和幼胚培养。幼胚需要较高的蔗糖浓度，以提供较高的渗透压，但由于幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，并具有较高的渗透压，所以人工培养基中要创造高渗透压的条件，使它可以调节胚的生长，阻止可能渗透压的影响，并能抑制中早熟萌发中的细胞延长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。Nitch、MS、B5 培养基；胚乳看护培养：培养基中加同种/相近种的胚乳。高浓度蔗糖（812%）：模拟胚乳高渗环境；适量的激素：GA3、 IAA等，刺激幼胚发育。温度：对于大多

5、数植物的胚来说，在2530为宜。光暗交替培养较为有利。4. 离体胚发育(fy)途径1) 一种是继续进行正常(zhngchng)的胚胎发育，维持“胚性生长(shngzhng)”；2）另一种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为 “早熟萌发”；指幼胚在离体培养条件下，越过正常胚胎发育阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长成幼苗的现象。越过某一发育时期，如子叶形期而提早萌发，苗瘦弱，常死亡。措施：增加培养基中糖和无机盐的浓度，提高培养基渗透压。添加 ABA；高温、强光照下培养。3）第三种是在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基

6、。特别是进行生长调节时，就更为如此。培养基成分不适宜，如激素浓度较高，幼胚（较多胚性）愈伤再生植株。二、胚珠培养将受精或未受精胚珠进行离体培养。1. 胚珠培养的用途1）成熟胚小或幼胚培养难成活时，用受精胚珠培养。1958，Maheshwar，授粉5d 的罂粟胚珠（合子或2细胞原胚）培养得到种子。2）未受精胚珠培养可诱发大孢子发育成单倍体植株，克服花粉(hufn)单倍体植株白化苗问题。1980开始，非洲菊、烟草、甜菜(tinci)、柑橘等成功。3）未受精胚珠培养(piyng)可为离体受精提供雌配子体。2. 胚珠培养技术花蕾取子房灭菌无菌水冲洗 取胚珠接种培养。有时，连同胎座或用子房进行培养。3.

7、 影响胚珠培养的主要因素1）胚囊发育时期：是关键，水稻未受精胚珠培养单核四核期较好。2）胎座和子房：提供营养和激素。3）培养基：常用Nistch，MS、N6、B5也可。三、胚乳（endosperm）培养胚乳：被子植物双受精产物，三倍体；大多数植物随胚的发育，胚乳常被耗尽（豆科、葫芦科）。在胚乳培养中，除少数寄生或半寄生植物可以直接从胚乳分化器官以外，绝大多数被子植物的胚乳，无论成熟还是未成熟，都要先经历愈伤组织阶段，然后才能分化出植株。1. 胚乳培养的用途1）获得三倍体：无籽西瓜、香蕉、甜菜、杨树等，重要经济价值。2）获得非整倍体：如三体，遗传研究和育种材料。3）获得同源(tn yun)六倍体

8、：将胚乳三倍体加倍。4）理论研究系统(xtng)：均质薄壁细胞，研究淀粉、蛋白、脂类等生物合成代谢。 2. 胚乳培养(piyng)技术取授粉后412 d 的幼果常规消毒切开果实、取种子 剥取/分离胚乳 接种暗培养愈伤组织分化培养 器官或体胚途径再生植株。3. 影响胚乳培养的主要因素1） 胚乳发育时期 受精胚乳核 游离核型期 细胞型期（有壁）。取细胞型期、旺长的胚乳易成功（胚已分化），半透明固体状、有弹性；大戟科等木本植物，成熟胚乳也可。2）培养基成分常用White, LS, MS等;添加CH等有机物和激素：可促进愈伤形成。3）胚因子的影响幼胚乳带胚易成功；成熟胚乳常不能脱分化，需先进行“原位胚

9、”萌发使其活化，借助“胚因子”才能形成愈伤。GA3可部分代替胚因子的作用。四、离体授粉（in vitro pollination）在人工控制条件下，使离体的胚珠、子房、胎座或雌蕊等完成授粉、受精(shu jng)，形成种子的过程。包括雌蕊/子房离体受精和胚珠试管受精。1. 离体授粉(shufn)的意义1）克服(kf)远缘杂交的不亲和性受精前不亲和：花粉不能萌发；花粉管不能进入胚珠；花粉管在花柱中破裂。2）克服自交不亲和性自交不亲和：花粉不能萌发；花粉管不能长入子房。3）诱导孤雌生殖用异源花粉授粉，诱导卵细胞、助细胞和反足细胞等产生单倍体。4）植物受精机制和生理研究。2. 离体授粉技术1）雌性外

10、植体的培养：取花蕾 去花瓣、花萼等 表面消毒剥取雌蕊、胚珠或子房等 接种培养。2）花粉的灭菌：取花药 收集花粉 表面消毒。3）离体授粉：将无菌的花粉授于培养的胚珠、子房、胎座等。方法：将花粉粒直接撒于胚珠；用花粉悬液注射或滴加于子房；将花粉授于培养的雌蕊柱头等。3. 影响离体授粉的因素1）雌性(c xn)外植体发育阶段：雌性外植体成熟度与培养(piyng)成活率一般呈正相关。2）花粉(hufn)萌发力：用钙、硼、蔗糖等对花粉进行预处理，提高萌发率。3）母体组织的影响：保留胎座、花柱等组织，并提供相关因子，可提高成功率和结实率。4）培养基：添加CH、增加蔗糖和B族维生素等，利于胚珠培养或促进花粉

11、萌发和花粉管生长。第二节 花药和花粉培养花药和花粉培养实际上都是通过培养小孢子获得单倍体再生植株。一. 培养条件下小孢子的发育1. 自然条件下小孢子的发育未分化花药孢原组织造孢组织小孢子母细胞四分孢子小孢子（单核早期 单核靠边期） 双核期（1个营养核+1个生殖核）成熟三核花粉（1个营养核+2个生殖核）。小孢子只进行2次分裂！从小孢子母细胞四分孢子，为孢子体；从单核小孢子成熟三核花粉，为配子体2 培养条件下小孢子的发育 小孢子第二次分裂偏离正常途径，四种情况：1）营养细胞发育(fy)途径；2）生殖细胞发育(fy)途径；3）营养(yngyng)细胞和生殖细胞并进发育途径；4）均等分裂途径。无论哪种

12、，花药单倍体愈伤/胚状体破药壁单倍体植株。二. 花药培养花药培养：指将花粉发育到一定阶段的完整花药接种到培养基上，诱导小孢子经孢子体途径形成单倍体再生植株的技术，又称雄核发育(androgenesis)。1 花药培养技术流程选花蕾表面消毒取花药+花丝镜检发育时期（醋酸洋红） 从花丝上摘花药接种培养。2 花药培养再生途经1）间接雄核发育：小孢子分裂产生愈伤，再经器官或胚状体发生途径形成小植株。2）直接雄核发育：烟草、曼陀罗等少数植物，小孢子直接分化成胚状体/花粉胚，待一定大小时为促进发育，移到生根培养基上形成小植株。3 影响花药培养的因素 1）基因型：重要因素。 2）供体植株生长条件：控制条件下

13、生长，便于根据花蕾或花药长度等判断花粉发育时期。3）供体植株(zhzh)的年龄：一般，幼年植株(zhzh)优于老年植株，开花初期优于开花后期。4）花粉发育(fy)时期：一般从单核早期到双核早期，进入二核期后发育方向预定，再作改变难度较大。5）花蕾和花药的预处理：低温：413，也可在接种后进行；热激：高于常温约5 ；饥饿：无糖或无氨基酸培养基；射线照射;秋水仙素、脱落酸、高低渗等。几十几天; 上述因子的结合可能更有效。目的: 诱导小孢子胚胎发生，促进花粉胚形成。机理: 可能调节细胞周期，改变细胞分化发育方向。6）培养基：MS、N6。蔗糖: 必须，且浓度较高。激素: 关键，如2,4-D在花粉愈伤和

14、胚诱导时必须，但在分化和发育时应降除。需经预实验确定。有机物、pH: 有些植物有一定要求。活性炭：可提高烟草、玉米等单倍体诱导率。7）培养条件：有些植物接种后经一定的低温或高温处理，可提高诱导率；一般在愈伤或花粉胚诱导阶段暗培养，分化(fnhu)阶段光照培养。 4 单倍体植株(zhzh)的加倍单倍体植株矮小(ixio)瘦弱、高度不育，须进行加倍。诱导剂：1）秋水仙素：微管聚合抑制剂，注意时间和剂量。可在培养的任何时期加倍，如在培养基中添加、浸苗、涂抹茎芽生长点等。是诱变剂，时间过长易出现混倍体和嵌合体，并引起变异。2）氟乐灵: 微管聚合抑制剂，比秋水仙素药效大。三. 花粉培养花粉培养：将离体的

15、花粉粒接种到培养基上，诱导形成单倍体再生植株的技术。花粉的二型性（pollon dimorphism）：在自然或离体培养条件下，同一花药中存在大、小2种类型花粉粒，通常小花粉/S-花粉在适宜培养条件下会发育成胚状体，而大花粉为非胚性，朝成熟花粉方向发展，此现象即。S-花粉又称胚性花粉, 即E-花粉。早期镜检发现：1 花粉与花药培养的比较1）异同点：（1）培养目的相同，均获得小孢子植株。（2）外植体不同，花药（器官）与花粉(hufn)（细胞），花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。（3）单倍体起源(qyun)的本质同，（4）花粉(hufn)比花药培养技术难度大。2）花粉培养的优势：（1）

16、花药中有害物质会影响小孢子的第一次分裂，花粉培养不存在此问题。（2）花粉植株都是单倍体，不含由药壁、花丝等诱导的体细胞植株。（3）花粉是研究发育、吸收、遗传、转化和诱变的理想材料。花粉培养的优势：2 花粉的分离与培养2.1 分离花粉的方法1）自然释放法：花蕾消毒花药接种于液体或固体培养基花粉释放去药壁。2）研磨过滤收集法：花蕾消毒培养基/分离液里研磨筛网过滤离心收集洗涤接种。3）剖裂/挤压释放法：用工具剖裂或用玻棒、注射器活塞挤压花药（在液体培养基中）释放花粉培养。2.2 花粉培养技术 1）液体(yt)浅层培养：用液体培养基将小孢子(boz)配成悬液，取少许在培养皿中形成一薄层，待愈伤或胚状体

17、形成后再转移到分化或发育培养基上。2）固体(gt)平板培养。3）看护培养：花药上放滤纸，滤纸上放花粉。4）微室悬滴培养：制备花粉悬滴，即每个皿滴几滴花粉液，将皿倒置培养，便于观察。5）条件培养：培养花药（几天）沸水杀死研碎离心取上清加入培养基接种花粉。提取液中有促进发育因子。花粉培养的植板率：形成愈伤/胚状体的花粉数占培养的花粉总数的百分比（%），即为。四. 小孢子单倍体诱导的分子机制研究目的：克隆特异/相关基因，进行遗传操作和控制。油菜、小麦、烟草等，已鉴定、分离出一些基因。初步结果：一些为花粉萌发和受精所必须的花粉特异性基因的下调表达与孤雄生殖的诱导有关，所以关闭或抑制这些基因的表达应是遗

18、传操作的目标。五. 花培中存在的问题1 禾本科的白化苗现象禾本科花药和花粉培养中白化苗达1030%，甚至更高。影响白化苗形成的因素：1）基因型和花粉(hufn)发育时期；2）高温、高浓度2,4-D、分化培养不及时(jsh)：增加白化苗。3）低温处理：随植物而异，水稻长时间低温处理增加白化苗，大麦(dmi)相反。白化苗产生机理：不清楚。质体基因组变异、花粉染色体畸变、花粉有丝分裂中质体不能分化并降解，均可能诱发白化苗。预防对策：花药预处理、调整激素种类和配比、及时进行分化培养等，诱导胚状体发生是关键。5.2 普遍问题1）诱导率较低且不稳定：2）得到混倍体：有单倍体、二倍体、四倍体等。由于单倍体生长弱，易被掩盖和淘汰。3）单倍体加倍并不总是能产生纯合体，加倍的双单倍体有时出现后代分离。第三节 单倍体及其应用单倍体(haploid)：指具有配子染色体数的个体或组织，即体细胞染色体数为n。1）一倍单倍体：源于二倍体（2X）；2）多倍单倍体：源于多倍体（4 X、6X）。双单倍体 (Double Haploid, DH）：由单倍体加倍后形成，也称DH系、DH群体。 1. 单倍体的起源及其遗传(ychun)行为 1