HLAA0201BSP融合基因的构建与原核表达

1、HLA-A*0201-BSP交融基因的构建与原核表达孙万军，杜建芳，徐东刚，邹民吉，王金凤，蔡欣，王颖，王嘉玺，艾辉胜【摘要】克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A*0201-BSP交融基因的表达载体，以制备HLA-A2四聚体。按照已报道的序列方案特异引物，利用逆转录聚合酶链反响RT-PR要领从已断定为HLA-A*0201基因型的康健人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因，拼接上依靠生物素-卵白毗连酶bitin-prtEinligase，BirA的可生物素化序列BirAsubstratepepti

2、de，BSP，构建HLA-A*0201-BSP的原核表达载体，在大肠杆菌DH5中举行表达。效果表白：乐成扩增出HLA-A*0201-BSP交融基因并测序证明，构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5中高效表达HLA-A*0201-BSP交融卵白，表达量占菌体总卵白的28%，以包容体的情势表达，经洗涤、变性后，以SepharylS-300HRS-300柱层析纯化，纯度可达90%以上。结论：得到了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株，创立了轻便有用的包容体纯化要领，为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠基了基矗【关键词】HLA-A*0201；HLA-A*

3、0201-BSP交融基因；HLA-A2四聚体；可生物素化序列lningandExpressinfHLA-A*0201-BSPKeyrdsHLA-A*0201;HLA-A*0201-BSPfusingene;HLA-A2tetraers;BirAsubstratepeptide重要构造相容性复合体H-类分子漫衍在全部有核细胞的外貌，其作用是将细胞内颠末加工的抗原肽呈递到细胞外貌，并充当T细胞受体TR识别抗原肽的限定性分子。在抗原呈递细胞外貌的H-类分子与抗原肽构成的复合物被TR识别后，抗原特异性D8+T细胞在共刺激分子的帮助作用下被激活，产生细胞增殖并排泄细胞因子，进而在机体抗肿瘤、抗熏染及抗移

4、植物等免疫反响中发挥紧张作用。1996年，Altan等1首创的H-肽四聚体技能正是基于对这一体内识别历程的体外模拟，得到了对抗原特异性D8+T细胞的准确定量，成为定量检测抗原特异性T细胞的金尺度。本研究应用基因工程技能，在乐成克隆了HLA-A*0201重链胞外区基因后，将依靠生物素-卵白毗连酶bitin-prteinligase，BirA的可生物素化序列BirAsubstratepeptide，BSP毗连到其胞外区末了，构建成交融表达载体，在大肠杆菌DH5中得到了高效表达，并对得到的交融卵白举行了纯化，为进一步制备抗原特异性的HLA-A*0201四聚体奠基了基矗质料和要领质料大肠杆菌E.liD

5、H5和质粒pBV220均为军事医学科学院底子医学研究所基因工程研究室保存。TRIZL试剂、RT-PR试剂、限定性内切酶ER和BaH、T4DNA毗连酶、DNA凝胶接纳试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒购自Prega公司。淋巴细胞分散液购自GibBRL公司。SepharylS-300HRS-300胶为Pharaia公司产物。尿素、二硫苏糖醇等为入口或国产阐发纯试剂。要领HLA-A*0201基因型康健人白细胞总RNA抽提及DNA合成取HLA配型查抄断定为HLA-A*0201基因型的康健成年志愿者肝素抗凝静脉血2l，按通例要领以淋巴细胞分散液分散外周血单个核细胞，以TRIZL试剂提取总RNA，直接举行逆转

6、录反响。反响体积为20l。起首在6lDEP水中参加2g总RNA，10l/LligdT1l，在70变性5分钟后置冰裕再参加5反响缓冲液4l，2.5l/LdNTP混淆物2l，RNasin40U，及AV逆转录酶10U，42反响1小时后，于85温育5分钟停顿反响，合成的DNA即可用于PR扩增或存-20。RNA完备性以1%琼脂糖凝胶电泳及扩增管家基因GAPDH举行验证。HLA-A*0201重链胞外区基因的PR扩增按照IGT/HLA数据库中的HLA-A*020221的DNA序列方案引物。上游引物P1为：5-GGAATTATGGGTTATATGAGGTATTT-3，含起始暗码子，ER识别位点。卑劣引物P2为

7、：5-TGAGGGGTTGGGAAA-3。引物由上海博亚生物技能合成。该对引物扩增出的片断为HLA-A*020221重链胞外区基因1-811碱基序列。PR反响在20l体积中举行，以0.5lDNA第一链为模板，反响条件为在94变性5分钟，然后94变性30秒，52退火30秒，72延伸40秒，共举行32次循环后，于72延伸7分钟。得到的PR产物称为A2。交融BSP序列的HLA-A*0201重链胞外区基因的重叠延伸PR扩增为在HLA-A*020221重链胞外区成熟卵白序列1-276氨基酸羧基端毗连可生物素化序列BirAsubstratepeptide，BSPLHHILDAQKVNHR，方案的引物P3如

8、下：5-GGGATTTAAGATGATTAAATTTTTGTGATAGAATATGATGAGAGAGGGTATTAGGGTGAGGGGTTGGGAAA-3，此中包罗HLA-A*020221重链胞外区基因812-828碱基、编码Gly-Ser讨论和BSP的DAN序列，以及停顿暗码子、BaH识别位点。重叠延伸PR反响在20l体积中举行，以0.5l上述得到的PR产物A2为模板，仅参加1l引物P3，在94变性5分钟，然后94变性30秒，56退火30秒，72延伸40秒，共举行8次循环；之后，在上述反响体系中参加引物P1，在94变性3分钟，然后94变性30秒，52退火30秒，72延伸40秒，共举行25次循

9、环；再于72延伸7分钟。得到的PR产物即为HLA-A*0201-BSP交融基因片断。HLA-A*0201-BSP交融表达载体的构建及测序断定质粒提娶酶切、毗连、转化和断定等，均按Sabrk实行手册2举行。将扩增的HLA-A*0201-BSP交融基因片断接纳后，以ER和BaH双酶切，与经相应酶切后的质粒pBV220毗连，转化E.liDH5感觉态细胞，涂板，挑克隆及小量扩增后，以碱裂解法提取质粒，双酶切法挑选接入HLA-A*0201-BSP交融基因的转化子，提交上海博亚生物技能举行测序。SDS浓缩胶浓度为5%，分散胶浓度为15%，以考马斯亮蓝R250染色表现卵白条带。效果HLA-A*0201-BS

10、P交融基因的PR扩增按照IGT/HLA数据库中的HLA-A*020221的DNA序列方案引物P1、P2，以HLA-A*0201基因型的康健人白细胞总RNA逆转录第一链DNA为模板举行PR反响，扩增出一条与估计巨细822bp符合的DNA片断图1。该DNA片断为HLA-A*020221重链胞外区基因1-811碱基序列。又以上述得到的PR产物A2为模板，以引物P1、P3经重叠延伸PR扩增出1条与估计巨细901bp符合的DNA片断图2。该DNA片断可编码HLA-A*020221重链胞外区1-276氨基酸和BSP，并编码两者间的Gly-Ser讨论。HLA-A*0201-BSP交融表达载体的构建及断定经P

11、R扩增出的长度为901bp的DNA片断经ER和BaH双酶切后，与同样酶切的pBV220毗连，转化DH5，挑选接入目的基因的阳性克隆图3，经测序证明插入序列为含起始暗码ATG，且准确编码HLA-A*020221重链胞外区1-276氨基酸和BSP的基因，与IGT/HLA数据库中宣布的HLA-A*020221序列、Altan等1报道的BSP序列完全同等。构建的表达载体称pBV220-HLA-A*0201-BSP。HLA-A*0201-BSP在E.li中的表达和纯化讨论H-类分子是由具有高度多肽性的重链和守旧的轻链,即2-微球卵白构成的异源二聚体。在抗原呈递细胞AP内合成的抗原短肽，即结合于由H-类分

12、子重链的1和2布局域构成的肽结合槽内，而2-微球卵白2与重链的3布局域的非共价结合使H-类分子-肽复合物越发不变，终极定位于细胞外貌，并通过与抗原特异性的D8+T细胞外貌的TR彼此作用使之激活，进而杀伤靶细胞。假设在体外制备H-肽复合物，模拟AP/特异性靶细胞外貌H呈递的多肽复合物，通过与体内T细胞的TR特异性结合，就可到达直接检测抗原特异性T细胞的目的。但可溶性的H-肽复合物单体与TR结合的亲和力很低、解离速率快。H-肽四聚体技能那么落服了这一困难，其精良之处在于利用基因工程技能得到H-类分子重链时，在其羧基端交融1段由15个氨基酸构成的BirA酶依靠的可生物素化序列BSP，从而可以利用Bi

13、rA酶在BSP序列内的赖氨酸残基上接一个生物素分子3。在此交融卵白与2、抗原肽折叠成可溶性H-肽单体分子后，即可对其生物素化。利用1分子链亲和素可结合4分子生物素的性子，进一步与荧光标识表记标帜的链亲和素结合，便可得到均一的四聚体。结合流式细胞术，即可用于抗原特异性T细胞的定性和定量阐发4,5。为制备HLA-A*0201-肽四聚体，起首需克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区。之以是选择HLA-A*0201，是由于汉族群体中此基因频率在类分子中最高，凌驾30%的个别表达此分子6。如今对H-肽单体的生物素化重要接纳BirA酶对可识别序列BSP的生物素化和化学试剂生物素化两种形式7。

14、本研究亦接纳了在HLA-A*0201的重链胞外区羧基端交融BSP序列的计谋来实现生物素化目的。在进一步的实行中，我们又探究了对HLA-A*0201的重链胞外区实行化学试剂生物素化的形式，也获乐成另文颁发。选择符合的载体-宿主体系是外源基因在原核体系内高效表达的关键之一。本研究选用了含有PRPL启动子的表达载体pBV220构建交融表达载体pBV220-HLA-A*0201-BSP，重要是思量该载体为温控型表达载体，相对付需利用异丙基硫代-D半乳糖苷IPTG举行诱导的表达载体如pET系列载体等而言，其诱导要领轻便、本钱低廉，且目的卵白表达不变。这对付制备大量纯化的目的卵白以构建HLA-A*0201-肽四聚体无疑是具有相称上风的。在转化至pBV220最适宿主菌E.liDH5诱导后创造，目的卵白重要存在于包容体中，表达量约占菌体总卵白的28%。形成包容体使目的卵白免受胞内酶的落解作用，易于以高纯度和高浓度方法分散。在得到HLA-A*0201-BSP包容体后，经洗涤、尿素溶解，以S-300柱层析纯化，即可得到较高纯度90%的重组卵白，要领轻便，完全满意制备四聚体的必要。因此，无需为了纯化便利而在HLA-A*0201-BSP的端交融His6标签8，且末了引入外源氨基酸，从而大概半数叠形成HLA-肽复合物单体造成影响，使终极得到的四聚体特异性产生改变。通过原核表达得到的HLA