两种不同培养方法对破骨细胞ATPase a3基因表达和骨吸收活性的影

1、两种差异造就要领对破骨细胞ATPase a3基因表达和骨汲取活性的影杜文喜肖鲁伟吴承亮厉驹童培建【摘要】目的探究差异要领造就下的大鼠破骨细胞(stelast，)骨汲取成效的差异，以及骨汲取关键基因ATPasea3的RNA表达程度的差异，为体外实行奠基基矗要领机器分散和诱导造就，即重新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机器分散成熟和1,25(H)2D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(stelastlikeell，L)，对得到的举行形态和骨汲取成效不雅察，并测定骨汲取关键基因ATPasea3的RNA表达程度的差异。效果和L均为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantaidphsphata

2、se，TRAP)染色阳性的多核巨细胞，与细胞共造就骨片上可形成骨汲取陷窝；诱导法造就出的L数量多于机器分散法，但诱导早期陷窝较之小而浅，诱导后期根本靠近；骨汲取关键基因ATPasea3的RNA，在机器分散8h与诱导造就6天的细胞表达量无明显差异，但都远少于造就8天的表达量。结论诱导法可以培养出大量的L，优于机器分散法，但早期骨汲取成效较弱，骨汲取成效与其核数相干。后期的L与机器分散靠近，可以用于各种实行。【关键词】破骨细胞破骨样细胞骨汲取ATPasea31质料1.3盖玻片及骨磨片的制备将1010盖玻片，经硫酸-重铬酸钾洗濯液中留宿，蒸馏水超声波洗濯，天然晾干，高压消毒后备用。取奇怪成年牛股骨皮

3、质骨，锯成厚骨片，经角磨机和细金刚砂纸磨至约15厚，再剪成55巨细，三蒸水中超声波洗濯后，天然晾干，利用前紫外线双面照耀各4h。2要领2.1大鼠机器分散法造就参考文献4要领操纵，造就1h后再用造就液冲洗，别离于4、8和10h取出盖玻片举行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantaidphsphatase，TRAP)染色，8h时抽提总RNA，并将与共造就24h的骨片甲苯胺蓝染色。2.3的形态不雅察别离对差异要领造就的细胞举行不雅察，TRAP染色。将待定造就时间的细胞爬片取出，根据文献4要领与步调举行染色，甘油明胶封片，光镜不雅察。此中诱导造就法中的L含2个胞核以上且呈TRAP染色阳

4、性的细胞即为。在200倍光镜下举行计数，每个玻片上随机选择10个视野，计数阳性细胞均值并做统计。3效果3.1形态不雅察新生大鼠机器分散的细胞数量较多，匀称平铺。造就1h后，大部门未贴壁细胞被199冲走，此时可见到玻片上多核。4h后细胞形态清楚，外貌有微绒毛，呈伪足样活动，细胞形状不竭变革，部门细胞之间纤维样突出毗连图1，随着造就时间的延伸，细胞充实舒展，体积变大，核仁清楚可见。但造就24h后，大部门细胞壁增厚，核固缩，微绒毛消散。含1,25(H)2D3诱导剂的大鼠骨髓细胞悬液接种于造就板后，4h见细胞匀称漫衍于造就板底部，呈短梭形贴壁生长。诱导造就6d时，可见体积较大、多核310个的L，呈圆形

5、、多角型等多种形态，时有细胞突起向外延展，胞质密度较低，细胞核或集聚在细胞中心，或散在细胞周边，核内可见12个核仁不等图2，四周的单核细胞不竭交融在较大的L中，细胞核渐渐增多，与机器分散造就4h的相似。随着造就时间的延伸，L数量递增，8d时达峰值，后期细胞开始空泡变性，细胞裂解碎片增长，细胞核出现固缩、碎裂，细胞膜破碎，细胞殒命。3.2TRAP染色TRAP染色是断定的特异性酶学染色要领，TRAP染色阳性TRAP+为：细胞质染成赤色或酒赤色，细胞核不着色。机器分散的细胞造就4h后可见到典范的TRAP+的，造就8h、10h与4h比拟力TRAP+的数量没有明显差异P0.05见表2，但到10h时细胞萎

6、缩，空泡变性显着图3。诱导造就第6d开始，可见多核TRAP+细胞，之后TRAP+的细胞渐渐增多，出现较大型的多核细胞，并在第8d数量到达岑岭图4，与别的时间组差异显着P0.01，11d时TRAP+细胞淘汰，细胞着色渐渐变淡，颜色转昏暗，第14天TRAP+细胞完全消散。见表3图1机器分散造就4h，外貌有微绒毛小箭头，细胞之间纤维样突出毗连大箭头。(倒置显微镜200)略图2诱导造就第6天，单核细胞之间，出现体积较大、多核L箭头。(倒置显微镜400略图3机器分散造就10h，TRAP染色阳性，空泡变性小箭头。(TRAP染色200)略图4诱导造就第8天，TRAP染色阳性的多核细胞燕尾箭头，单核细胞核增多

7、，体积增大三角箭头，TRAP+的单核细胞白色箭头。(TRAP染色200略表1各基因引物序列及片断巨细略表2机器分散法差异时间TRAP+细胞个数略差异造就天数之间比力P0.05表3差异诱导天数TRAP+细胞个数略差异造就天数之间比力,P0.05,P0.05,P0.013.3骨汲取成效不雅察骨片上汲取陷窝是骨汲取的直接效果，其陷窝数量、巨细和深度直接反响骨汲取的本领。机器法造就24的骨片甲苯胺蓝染色后，在光镜下可见汲取陷窝呈蓝紫色圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态(图5)，界限清楚，部门出现穿凿样改变。而诱导造就8d时，在骨片上创造少量呈蓝紫色小陷窝，随着诱导时间的延伸，陷窝的数量、深度均增长，12d时可见大量的汲取陷窝(图6)。经扫描电镜不雅察可清楚识别骨汲取陷窝，成熟的骨汲取陷窝较L深，底面粗糙，可见有纤维样基底(图7)，但是雷同面积巨细的骨片上，诱导12d的骨陷窝数量显着多于机器法。机器法造就24的骨汲取陷窝比诱导造就8d形成的骨陷窝面积略多，但远少于诱导12d