产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G突变体的构建

1、产红霉素C的糖多孢红霉菌A226G-突变体的构建袁华黄训端张部昌刘道琴赵皓孔小卫张书祥红霉素(erythryin，Er)是由革兰阳性细菌糖多孢红霉菌(Saharplyspraerythraea)合成的次生代谢产物，为一类大环内酯类抗生素，包罗红霉素A(ErA)、红霉素B(ErB)、红霉素(Er)和红霉素D(ErD)等。这四种红霉素均有抑菌活性，但在临床上抑菌活性最高，用途最普及的是ErA1，2。红霉素生物合成的基因以单一拷贝、成簇情势存在于糖多孢红霉菌的环形染色体上，质粒不到场红霉素的生物合成1，3。1质料与要领1.1质料(1)菌种和质粒糖多孢红霉菌A226、大肠埃希菌ET125675和同源重

2、组质粒pH36由中国医学科学院医药生物技能研究所王以光传授惠赠；糖多孢红霉菌染色体整合型表达载体pZ7、大肠埃希菌DH58和克隆质粒pU18为本室保存；质粒pUG、pHG、糖多孢红霉菌突变体A226G-、质粒pZG和糖多孢红霉菌基因工程菌A226G-G+为本研究构建。硫链丝菌肽(thistreptn，Thi)、安普霉素(aprayin，A)和PEG3350为Siga公司产物，溶菌酶为Fluka公司产物，卵白酶K为Ares公司产物，TSB为Dif公司产物，限定性内切酶、T4DNA毗连酶和DNAarker(DL2000和DL15000)为大连宝生物公司产物，RNaseA、dNTP、pfu和TaqD

3、NA聚合酶为上海生工公司产物，质粒提取试剂盒和PR产物接纳试剂盒为道普生物科技(北京)产物，别的试剂为阐发纯。1.2要领(1)大肠埃希菌的造就、感觉态细胞的制备、质粒酶切、毗连、转化等按Sabrk等8要领或产物说明书举行；质粒提娶PR产物纯化按道普生物科技(北京)产物说明书举行。(2)糖多孢红霉菌A226的造就和基因组DNA的提取按Hpd等9要领举行。(3)GDNA片断重叠PR引物的方案上游片断Fra1引物：卑劣片断Fra2引物：(4)eryG基因PR引物的方案是按照GenBank宣布的糖多孢红霉菌红霉素eryG基因序列(GenBank登暗号A420293)，方案并合成了1对引物：(5)GDN

4、A片断和eryG基因片断的PR扩增按文献12操纵。(6)糖多孢红霉菌A226原生质体的制备和转化按文献13操纵。(7)糖多孢红霉菌A226:pHG整合体I和II及糖多孢红霉菌A226G-突变体的挑选按文献14操纵。(8)糖多孢红霉菌A226:pHG整合体I和II及A226G-突变体发酵液中红霉素身分的薄层层析(TL)阐发按文献4操纵。(9)糖多孢红霉菌A226:pHG整合体I和II的PR断定按文献14操纵。(10)糖多孢红霉菌A226G-突变体PR断定的引物序列方案按1.2(4)节中方案的引物序列。(11)糖多孢红霉菌A226G-突变体发酵液中红霉素身分的质谱(S)阐发按文献14操纵。2效果与

5、阐发2.1同源重组质粒pHG的构建以糖多孢红霉菌A226基因组DNA为模板，PR先扩增出上游片断Fra1和卑劣片断Fra2，再以Fra1和Fra2为模版、P11和P22为引物，用重叠PR扩增出全长约1600bp的DNA片断G，克隆到pU18载体上构建质粒pUG。序列阐发表白，所克隆的GDNA片断序列与GenBank宣布的序列完全同等(290bpDNA片断已被删除，测序图略)。pH3质粒6为穿梭型质粒，在糖多孢红霉菌中不克不及不变存在，故可作为糖多孢红霉菌的同源重组质粒。pUG质粒中外源DNA用ERI和HindIII酶切后连于pH3质粒相应酶切位点上，转化大肠埃希菌DH5得到了pHG质粒(Fig

6、.1)。为制止糖多孢红霉菌对外源基因的限定性作用(甲基DNA限定)15，将pHG质粒转化大肠埃希菌ET12567，得到了无甲基化修饰的pHG质IdentifiatinfpHGutbyERI/HindIII粒。2.2糖多孢红霉菌A226:pHG整合体I和II的挑选将糖多孢红霉菌A226制成原生质体，用pHG质粒转化，在含30g/lThi的R3固体造就基上举行筛眩因pHG质粒在糖多孢红霉菌中不克不及复制，只有整合到染色体上才气给予菌体不变的Thi抗性。从转化平皿中挑取110个单菌落涂含30g/lThi的R3歪面，有2个菌落可正常生长，别离定名为A226:pHG整合体I和II。提取整合体I和II基因

7、组DNA做模板，别离以质粒pHG和动身菌株A226基因组作为阳性和阴性比较，PR扩增pHG质粒上Thi抗性基因tsr举行断定。1.2%琼脂糖凝胶电泳效果表现，整合体I和II的PR产物与阳性比较一样，巨细位于768bp四周，与预期符合，而阴性比较并无此条带(Fig.2)，表白pHG质粒已整合到A226的染色体上。糖多孢红霉菌红霉素生物合成基因在染色体上以单一拷贝、成簇情势存在，此中eryAI、eryAII、eryAIII、eryII、eryIII、eryBII和eryG为一条多顺反子，配合受到eryAI启动子的操纵1。假设pHG质粒与A226染色体在同源片断Fra1内产生同源重组，那么eryG基

8、因的表达将会受到按捺，整合体发酵液就会积聚ErA生物合成的中心产物Er；假设在同源片断Fra2内产生同源重组，那么eryG基因的表达将不会受到影响，整合体仍旧可以合成ErA。为了确定pHG质粒的整合位置，提取整合体I和II发酵液中的红霉素举行薄层层析(TL)，TL效果表现整合体I是在同源片断Fra1内产生同源重组的，而整合体II是在同源片断Fra2内产生同源重组的(Fig.3)。2.3糖多孢红霉菌A226G-突变体的挑选同源重组质粒pHG在染色体上不不变，在无抗生素选择压力时会自觉产生染色体内二次重组而脱落。假设第二次重组与第一次重组产生在同一同源片断内，质粒脱落伍染色领会复兴到质粒整合前状态

9、，菌株规复ErA合本钱领；假设第二次重组与第一次重组产生在差异的同源片断内，质粒脱落伍eryG基因DNA序列会产生删除突变，突变株将失去ErA合本钱领，发酵液中会有Er的积聚。糖多孢红霉菌A226:pHG整合体I在无Thi的R3歪面上一连生长三代后，将制得的原生质体差异浓度稀释液涂无Thi的R3平皿。从平皿中挑取约1000个单菌落，各一连涂含30g/lThi的R3歪面和无Thi的R3歪面，此中有5个菌落仅可以在无Thi的R3歪面上生长，表白这5个克隆中同源重组质粒pHG已从A226染色体上脱落下来。提取这5个克隆的红霉素做TL，效果表现只有4号克隆仅可以积聚Er，此克隆被定名为A226G-(F

10、ig.4)。别的4个克隆都为复兴突变，即规复了ErA的合本钱领。将A226G-突变体举行液体造就，提取基因组DNA，以eryG基因上游引物P1和卑劣引物P2举行PR扩增，A226G-突变体PR产物的条带显着地比A226的要小(Fig.5)。对A226G-突变体的PR产物直接举行序列阐发也表白此突变株eryG基因中心部门预期的290bpDNA片断已被删除(测序图略)。2.5A226G-突变体中eryG基因的成效赔偿(1)糖多孢红霉菌表达质粒pZG的构建以糖多孢红霉菌A226总DNA为模板，以P1和P2为引物PR扩增出eryG基因，克隆到pU18载体上构建了质粒pUG。序列阐发表白，所克隆的ery

11、G片断序列与GenBank宣布的序列完全同等(测序图略)。将pUG中的eryGDNA片断亚克隆至糖多孢红霉菌表达载体pZ中，构建了质粒pZG。NdEi和ERV酶切pZG质粒后得到预期巨细的两个片断(Fig.7)。(2)互补试验将糖多孢红霉菌突变体A226G-制成原生质体，用pZG质粒转化，在含125g/lA的R3固体造就基上举行筛眩从转化平皿中挑取6个单菌落涂含125g/lA的R3歪面，这6个克隆均可正常生长，定名为A226G-G+I、II、III、IV、V和VI。接种A226G-G+I和A226于100lTSB造就基/500l三角烧瓶中，30振荡造就120h，提取发酵产物红霉素，TL效果表现

12、A226G-G+I规复了ErA的消费本领(Fig.8)。3讨论基因敲除技能是20世纪80年代末生长起来的一种新型分子生物学技能，是通过必然的途径使机体特定的基因失活或缺失的技能，因此基因敲除技能在特定基因成效的研究中表现出越来越紧张的职位。通常意义上的基因敲除重要是应用DNA同源重组原理，用方案的同源片断交换靶基因片断，到达基因敲除、失活的目的。Reeves等17通过S1核酸酶庇护实行猜测红霉素eryG基因大概有单独的启动子，但迄今为止并没有有力的文献证明。在本研究中，整合体I红霉素发酵液乙酸乙酯提取物经TL阐发仍可见到少量的ErA斑点(Fig.3)，S阐发也表白发酵液中既有Er又有ErA(图谱略)，说明纵然是在同源片断Fra1内产生同源重组也没有完全阻