补充2蛋白质理化性质课件(PPT 88页)

1、第五章蛋白质的通性、纯化和表征第1页，共88页。目的要求1、掌握蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。2、熟悉蛋白质分离纯化的一般原则，掌握蛋白质分离纯化方法。3、掌握蛋白质的含量测定与纯度鉴定。重点难点1、蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。2、蛋白质的分离纯化方法。第2页，共88页。一、蛋白质的酸碱性质1. 蛋白质分子的可解离基团 2. 等电点：使蛋白质分子所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零的溶液pH。（与AA相同）蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数目以及溶

2、液的pH。 第3页，共88页。 每种蛋白质都有特定的等电点，这是鉴别蛋白质的指标之一。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。第4页，共88页。3. 等离子点蛋白质的等电点在有中性盐（Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42-）存在下可以发生明显的变化。等离子点：蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。等离子点是一个特征常数 第5页，共88页。二 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于1100nm，该分散系统为胶体溶液系统。布郎运动、丁道

3、尔现象、不能透过半透膜）。胶体系统保持稳定的三个因素 颗粒大小在1100nm范围内颗粒表面带有同种净电荷与水形成水化层（一）胶体性质第6页，共88页。第7页，共88页。 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。应用:(1)蛋白质分离纯化(2)解毒(3)临床检验（二）蛋白质的沉淀 第8页，共88页。 引起蛋白质沉淀的原因1、加入脱水剂以除去它的水化层。2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带相同净电荷。3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大的质点而沉淀。第9页，共88页。+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白

4、质水化层+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用 蛋白质的聚沉蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图第10页，共88页。(1) 盐析法( salting out)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质沉淀的方法特点：作用原理:盐离子与水的亲和力极强，可脱去蛋白分子表面的水化层；盐离子中和蛋白分子表面的电荷，最终蛋白质聚集沉淀。第11页，共88页。(2) 有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层，又能降低溶液的介电常数，增强异性电荷间的相互作用而使蛋白质分子聚集沉淀。 必

5、须在低温下操作注意事项:尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇、乙醇、丙酮缺点： 原理:常用有机溶剂:常会使蛋白质变性第12页，共88页。重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。(3) 重金属盐沉淀法常使蛋白质变性失活。若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：原理:第13页，共88页。生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子

6、形式存在 缺点： 原理:常引起蛋白质变性注意事项:第14页，共88页。（5）加热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速。原理： 1、蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层 2、破坏电荷情况第15页，共88页。第16页，共88页。（一） 纯化的目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原则 三 蛋白质分离纯化的一般原则第17页，共88页。（一）目标 蛋白质在生物体中一般都是以复杂的混合物形式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋白质，必须将其分离提纯到一定的水平。 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品

7、； 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活； 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。第18页，共88页。1、总目标 （1）增加制品的纯度（purity）或比活性（specific activity）即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性；（2）并且使目标蛋白质的产量达到最高值。（二）一般原则 第19页，共88页。2、分离提纯的一般程序 含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体 前处理 可溶性蛋白质混合物抽提液 粗分级分离已除去大量杂质的蛋白质浓

8、缩液 细分级分离高纯度的蛋白质制品第20页，共88页。 电泳 前处理粗分离细分离生物组织 无细胞提取液破碎、抽提、差速离心选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质凝胶过滤疏水层析吸附层析第21页，共88页。四 蛋白质的分离纯化方法 分离提纯蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间的各种特异性的差异，包括： （1）分子大小； （2）溶解度； （3）电荷不同； （4）选择性吸附； （5）对配体分子的生物学亲和力等。 第22页，共88页。（一）根据分子大小不同的纯化方法 1 透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)2 凝胶过滤(gel filtration) 第23页，共8

9、8页。1 透析和超滤* 透析(dialysis)利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质大分子与其他小分子物质分开的方法。* 超滤法 应用正压或离心力，使水和其他小分子通过半透膜而蛋白质被截留在膜上，达到浓缩或脱盐粗分级的目的。第24页，共88页。透析与超过滤简易装置第25页，共88页。超滤装置第26页，共88页。（1）凝胶过滤的介质2 凝胶过滤第27页，共88页。凝胶的网孔大小决定分离范围能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围Sephadex G-50 1 50030 000 有时用排阻极限来表示分离范围的上限,排阻极限指不能扩散进入凝胶网孔的最小相对分子量,如Sephade

10、x G-50的极限为30 000第28页，共88页。 常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）是由线型的-1,6-葡萄糖与1-氯-2,3-环氧丙烷反应而成,商品名为Sephadex 。聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP)是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共聚而成，商品名为Bio-Gel P。琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gel A)是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose或Bio-Gel A第29页，共88页。交联葡聚糖凝胶 Sephadex第30页，共88页。琼脂糖凝胶 Sepharose第31页，共88页。以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰胺（单体）聚

11、合而成聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-gel P）第32页，共88页。(2)凝胶过滤的原理第33页，共88页。凝胶过滤的原理： 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 第34页，共88页。应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱

12、盐、去热源和脱色。第35页，共88页。（二）根据溶解度差别纯化的方法 影响蛋白质溶解度的外界因素主要有：（1）溶液的pH，（2）离子强度I，（3）介电常数，（4）温度T。 根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的一种手段。第36页，共88页。利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用

13、。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。1. 等电点沉淀和pH控制 第37页，共88页。第38页，共88页。2. 盐溶和盐析 盐溶(salting in) 是指低浓度的中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象。盐析(salting out) 是指当中性盐的离子强度增加到足够高时，（如饱和或半饱和的程度），很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来的现象。 常用盐析盐类： (NH4)2SO4 ，NaCl等第39页，共88页。盐溶原理示意图第40页，共88页。盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此

14、排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。第41页，共88页。盐析原理示意图第42页，共88页。应用盐析是一种最常用的分级分离的方法之一,利用好了一步即能去大量的杂蛋白。现在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都已经利用盐析进行了沉淀并结晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白酶等。优点:保持蛋白质的天然构象,能再溶解第43页，共88页。鸡蛋清球蛋白沉淀滤液卵清蛋白晶体半饱和(NH4)2SO4卵清蛋白的分离全饱和(NH4)2SO4第44

15、页，共88页。3. 有机溶剂分级法 与水互溶的有机溶剂（如乙醇和丙酮）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低， 原因之一是降低了介质的介电常数，蛋白质表面的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集沉淀； 原因之二与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集沉淀。第45页，共88页。有机溶剂分级分离原理示意图第46页，共88页。4 温度对溶解度的影响 在低离子强度时，蛋白质的溶解度大多数在一定范围（约0-40）内是随着温度增加而增加的。但在40-50以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性介质中就会失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定。因此，蛋白质的分级分离操作

16、一般都要求在低温下进行。第47页，共88页。（三）根据电荷不同的分离方法 1 . 电泳 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。 F=FfqE=fV=v/E泳动度第48页，共88页。电泳的发展a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 第49页，共88页。Protein DenaturedPartialDenatured滤纸电泳 Cellulose薄层

17、电泳 (TLE) Cellulose acetate胶体 Starch Gel 电泳形式的演进第50页，共88页。圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。+ -+第51页，共88页。 纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。第52页，共88页。 （1） PAGE：PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳凝胶板分为两部分：浓缩胶分离胶PAGE垂直平板电泳示意图第53页，共88页。高效的分辨率浓缩效应电荷效应分子筛效应PAGE的三种分离效应第54页，共88页。第55页，共88页。（2）等电点

18、聚焦蛋白质是两性电解质当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)第56页，共88页。以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing，IEF)原理:第57页，共88页。第58页，共88页。 等电聚焦的运作机制：-+pH357911+-+-+-+-+-+Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology

19、 of the Cell (4e) p.487+-第59页，共88页。（3）双向凝胶电泳第60页，共88页。第61页，共88页。第62页，共88页。 2.离子交换层析法 不同载体： 离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖第63页，共88页。亲和层析法(AC) （七）利用对配体的特异生物学亲和力 的纯化方法 Pr琼脂糖小珠配体：凝集素，抗原，抗体金属螯合剂杂质杂质蛋白质 配体 蛋白质配体复合物第64页，共88页。第65页，共88页。配体的选择可选择配体的种类：抑制剂效应物酶的辅助因子类似底物抗体其它（外源凝集素，PolyA， PolyU 金属离子）第66页，共88

20、页。（六） HPLC原理：，GF，吸附层析技术上的改进颗粒力度小而均匀，机械性能强化学性能稳定高压柱，计算机辅助设备分辨率提高，效率提高第67页，共88页。第68页，共88页。第69页，共88页。五、蛋白质相对分子量的测定1.凝胶过滤法测定相对分子质量 第70页，共88页。Note：蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形）分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。第71页，共88页。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，在一定的范围内

21、，各个组分的洗脱液体积Ve与其分子量的对数成线性关系（反比）： Veb lg MWc第72页，共88页。优点：设备简单，不要求复杂的仪器对待测样品的纯度要求不高。待测样品可以是不纯的，只要具有专一的生物活性。第73页，共88页。聚丙烯酰胺凝胶：具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS） 第74页，共88页。 SDS 在蛋白质表面均匀附上一层负电： SDS（十二烷基磺酸钠），它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 1.4比例结合。 SDS可将蛋白质解离成亚基，

22、所以测出的分子量是亚基的分子量。 第75页，共88页。SDSPAGE的依据：物质分子量的差异性当SDS与蛋白质结合后：1)SDS使蛋白质分子即带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质分子间的电荷差别2）改变了蛋白质单体的构象，SDS-蛋白质复合体形状趋向一致，所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。 第76页，共88页。方法：用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成 SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带 负电（SDS带负电），且荷质比相同； 不同蛋白质分子具有相似的构象。 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们 的迁

23、移率作图 测出待测样品的迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量第77页，共88页。第78页，共88页。 六 蛋白质的含量测定与纯度鉴定：（一）总蛋白质含量测定： 凯氏定氮法：测样品中N含量双缩脲法：不十分精确，但较简便Folin-酚试剂(Lowry法)： 蛋白质标准测定方法：染料结合法（Bradford法）灵敏度较高, g水平 染料：考马斯亮蓝紫外吸收法： A280比色胶体金法(ng水平)第79页，共88页。（二）蛋白质的纯度鉴定 电泳：一条带 层析(HPLC)：一个峰 N-末端分析；一种AA第80页，共88页。一、单项选择题1. 构成蛋白质的氨基酸属于下列哪种氨基酸？（）。 A. L-氨

24、基酸 B. L-氨基酸 C. D-氨基酸 D. D-氨基酸2. 280nm波长处有吸收峰的氨基酸为（ ）。 A.精氨酸 B.色氨酸 C.丝氨酸 D.谷氨酸3. 有关蛋白质三级结构描述，错误的是（ ）。 A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性 B.三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构 C.三级结构的稳定性由次级键维持 D.亲水基团多位于三级结构的表面A. L-氨基酸B.色氨酸A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性第81页，共88页。4. 关于蛋白质四级结构的正确叙述是（ ）。 A.蛋白质四级结构的稳定性由二硫键维系 B.四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件 C.蛋白质都有四级结构 D.蛋白质亚基间由非共价键聚合。D第82页，共88页。二、多项选择题1. 蛋白质结构域（ ）。 A.都有特定的功能 B.折叠得较为紧密的区域 C.属于三级结构 D.存在每一种蛋白质中2. 空间构象包括（ ）。 A. -折叠 B.结构域 C.亚基 D.模序A B CA B C D第83页，共88页。三、名词解释1. 蛋白质等电点 2. 蛋白质三级结构3. 蛋白质变性 4. 模