7重组体克隆的筛选和鉴定

1、1第七章 重组体克隆的筛选和鉴定2一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。第一节 载体表型选择法1. 原理：3pBR3224（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2. pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：53. 选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因

2、失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活6无环丝氨酸培养基7（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。8二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以

3、被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。9假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏肽）。2. 选择过程10-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。11利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：第二节 根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长12小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受

4、体菌表现出外源基因的表型。2. 增加新性状13利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节 DNA电泳检测法 分子量 Marker载体重组克隆14二、酶切电泳筛选法1. 原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。15ABA或B1617不同克隆的酶切结果18筛选过程19三、PCR扩增检测法1. 原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2. 过程（1）从

5、重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。201. 核酸杂交第四节 核酸杂交检测法 一、原理：重组克隆与探针杂交。3. 识别标记32P 或 125I 。（1）放射性同位素2. 检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。（2）非放射性标记荧光素21二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1. Southern blotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。22酶切前酶切后插

6、入片断载体23Southern blot 筛选结果24（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。2526（2）R-环检测法DNA-RNA杂交。1）原理：2）选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。27缺点：需要电镜！282. Northern blotting用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。主要检测插入片断是否被转录。从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。29利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因

7、。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法 1. 抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交” 30待测基因 产物蛋白一抗二抗125I 标记的二 抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因 产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因 产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因 产物蛋白一抗二抗125I 标记的二抗 结合蛋白125I标记的二抗312. 放射性抗体检测法过程323. Broome-Gilbert双位点检测法质粒基因A插入基因B表达质粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。

8、33固相支 持滤膜抗A抗体125I标记的 抗B抗体质粒蛋白A外源蛋白B质粒蛋白A外源蛋白B固相支 持滤膜抗A抗体发光，底片曝光34二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1. 原理抗原抗体凝集反应。检测分泌型产物。2. 方法35对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。36三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary a

9、ntibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。37待测基因 产物蛋白一抗二抗酶 待测基因 产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶 19382. ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底39加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗40加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（

10、碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗41加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应4243在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色443.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）45临床检验常用的单抗46临床检验常用的单抗47 蛋白质印迹(western blot)，又称免疫印迹(immunoblotting) 是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。 Western Blot基本原理是通过特异

11、性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。Western Blot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。四、 Western Blot48(1) 聚丙烯酰胺

12、凝胶电泳（PAGE）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer PAGE49点样电泳方向50蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应Da道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿51DaltonSDS PAGE52凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。 硝

13、酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色53直接染色电泳结果54（2）Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白55Western装置56 Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤 维素膜一抗二抗辣根过氧 化物酶底物产物， 并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO57581）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（

14、二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。 Blotting过程Immuno Blotting59结果:多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果60一、无细胞翻译系统第六节 转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于mRNA转录丰度高的外源基因。61二、转译筛选mRNA无细胞翻译系统35S标记的 甲硫氨酸翻译35S标记的肽链PAGE电泳放射自显影比较放射性 带纹的

15、位置载体+外源DNA转录与预期的产物分子量相符？62三、杂交抑制转译法mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。单链mRNA核糖体 小亚基核糖体 大亚基能翻译mRNADNA核糖体 小亚基核糖体 大亚基不能翻译1. 原理632. 过程64四、杂交释放转译法1. 原理：在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。652. 过程硝酸纤 维素滤膜载体和插 入的cDNA总mRNAcDNA基因的 mRNA杂交洗脱cDNA基因的

16、mRNA体外翻译cDNA编码的蛋白电泳凝胶放射自显影cDNA编 码的蛋白硝酸纤 维素滤膜载体和插 入的cDNA硝酸纤 维素滤膜载体和插 入的cDNA收集35S标记的氨基酸66专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。待测蛋白质硝 酸 纤 维 素 滤 膜能与蛋白质结 合的DNA序列放射性标记待测蛋白质硝 酸 纤 维 素 滤 膜能与蛋白质结 合的DNA序列放射性标记五、DNA-蛋白质相互作用筛选法67一般克隆与筛选策略68第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）一

17、、哺乳动物基因转移的选择标记1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK选择原理四氢叶酸的必要性DHFR69氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 70胸苷酸激酶的补救作用TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk次黄嘌呤的补救作用细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉 抑制 抑制 71 HA

18、T培养基：Tk- 细胞株。TK基因。 宿主细胞 载体标记（2）TK选择过程含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有转入TK基因的细胞才能生存。722073真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（1） 选择原理二氢叶酸还原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸74DHFR+细胞二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存不需要补救！75DHFR- 细胞DHFR-

19、 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。需要补救！不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。76 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤补救胸苷补救无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:77DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。 宿主细胞（2）选择过程透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。 无核苷酸的培养基需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！78 氨甲喋呤“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。DHFR+基因。 载体标记只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+

20、livedie无核苷酸的培养基79是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。3. 新霉素抗性基因（neor）（1）选择原理 新霉素（neomycin）新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。 G418（geneticin）80 新霉素抗性基因-neor细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。G418真核细胞死亡G418存活neor真核细胞81含致死剂量G418的完全培养基。 G418培养基真核细胞株均可。neor基因。宿主细胞载体标记（2）选择过程G418：（100-800g/mL）82CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。氯霉素cat含氯霉素的完全培养基。真核细胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT）（1）选择原理（2） 选择条件（3） 宿主细胞（4）载体标记chloramphenicol acetyl transferase83在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。（5） CAT分析方法 免疫学检查：用抗