研究生实验课植物生理

1、研究生实验课植物生理实验课的要求掌握实验原理，学习方法。培养研究生的独立工作能力，科学、规范完成实验及其实验报告。学会打时间差，提高效率。研究生实验报告基本要求格式 实验题目：（居中）姓名 专业 学号 日期 成绩一、实验目的：二、实验原理三、实验器皿：四、实验步骤：1.*2.*五、实验记录六、实验结果与分析研究生实验报告基本要求每次实验完毕后一周内交实验报告B209。A4打印。中文用宋体，英文和数字用Times New Roman。数据进行统计分析。用Excel作图，图包括图序、图标、图线、图注等，注明参数及单位。表格采用三线表，必要时可加辅助线；表中参数应注明量和单位，如所有栏或大部分栏的单

2、位相同，可将单位标注在表的右上角，其余单位标注在相应的栏内；单位一律采用中华人民共和国法定计量单位。植物适应逆境机制生长发育与形态结构渗透胁迫与渗透调节植物激素与抗逆性活性氧及其清除系统逆境蛋白与抗逆基因植物抗性的交叉反应实验内容（40学时）酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量（）1植物的茎尖培养（）2气孔运动及其影响因素、钙参与ABA 调控气孔运动的信号转导（）3几种逆境相关生理指标的测定（）4常用仪器讲座（11月）5气孔运动及其影响因素 钙参与ABA 调控气孔运动的信号转导B116气孔是陆生植物与外界环境交换水分和气体的主要通道及调节机构。目的和意义探明植物激素和外界环境因素对气孔运动

3、的影响证明钙参与ABA对气孔运动的调控学习剥离表皮的方法和显微镜的使用气孔运动及其影响因素、 钙参与ABA 调控气孔运动的信号转导B116取3-4周龄蚕豆或鸭跖草幼苗最上端刚完全展开的叶片.暗处或光下预处理23h实验材料：1.钾离子对气孔开度的影响（3种处理）KNO3、 NaNO3与蒸馏水。2. CO2对气孔运动的影响（2种处理） 1 mol/L NaOH 溶液的大培养皿中，用烧杯罩住，其中CO2被NaOH所吸收。3. IAA和6-BA对气孔的作用 用的10mmol/L Tris或MES缓冲液配制不同浓度的IAA和6-BA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。关开促进气孔张开气孔

4、运动及其影响因素、 钙参与ABA 调控气孔运动的信号转导B1164. ABA和SA等植物激素对气孔关闭的作用用的10mmol/L Tris或MES缓冲液配制不同浓度的ABA和SA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）。5. Ca2+参与ABA调节气孔运动中的信号转导用的10mmol/LTris或MES缓冲液配制不同浓度的ABA溶液（0、10-4、10-5和10-6mol/L）、Ca2+（、1、10mmol/L）溶液、含有2 mmol/L EGTA的ABA系列浓度溶液，含有1 mmol/L LaCl3的ABA系列浓度溶液。处理2-3h，测量随机取3个视野，每个视野内随机取5（10）个

5、气孔。根据测量结果，作出处理浓度和孔径的关系图。分析各处理对气孔开度的影响。开关阻止气孔张开，诱导气孔关闭。气孔运动及其影响因素、 钙参与ABA 调控气孔运动的信号转导B116用反应板反应体系为2000mlBuffer 2000mlABA10-4 mol/L200mlA+1800mlBABA10-5 mol/LABA10-6 mol/LEGTA20mmol/LE+ABA10-4 mol/L200mlE+200mlA+1600mlB母液 ABA10-3 mol/L稀释到终浓度思考题测量前为何要进行照光或暗处理?ABA为何能影响气孔开度? 如何进一步证明钙参与ABA诱导气孔关闭的过程？附：互动显微

6、镜的使用基本步骤 Mie-设置（倍数、保存路径等） -预览（显示待观测视野） -测量（直线，每次一选） -读数。剥离表皮的方法：水中撕下表皮去叶肉细胞切0.50.3cm置处理液中酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量 抗原抗体反应的高度专一性和敏感性；酶的高效催化特性。原理固相抗原型（间接法）和固相抗体型（直接法）。目的和意义掌握间接法测定植物激素的原理和方法了解逆境对玉米根系ABA和IAA含量的影响间接酶联免疫原理示意图 示反应板（固相载体） 示激素特异抗体（一抗）示激素（抗原）示非特异二抗示蛋白质激素复合物示标记酶间接酶联免疫原理示意图 包被 洗板 竞争(-抗)洗板二抗 洗板底物显色 比

7、色 酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量实验材料自选材料和玉米幼苗（正常和盐胁迫，2个处理）实验步骤样品中激素的提取：提取：（ 4 4h）-封口膜（留孔） 吹干: （置于低温） 样品测定 包被 3h洗板 -上午11:0014:30（ 37 3h ） 竞争 30min（ 37）洗板 加IgG-HRP(二抗 ） 30min （37）洗板 加底物显色 15-20min 比色酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量1.样品中激素的提取计量 称取1g 左右材料，加2ml 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆(一定要磨细)，转入5ml试管，再用2ml 提取液分次冲洗研钵并转入试管中，摇匀。 在 4下提取4h

8、，30004000 rpm 离心1520min，取上清液，沉淀中加1ml 提取液，摇匀，置4下再提取1hr,离心，合并上清液。记录体积，残渣弃去。 上清液（约2-3ml）放青霉素小瓶中，置于真空干燥器中吹干。 或将一定体积的上清液转入表面皿中，吹干（低温保存）。 用样品稀释液定容(一般1g样品用1ml样品稀释液定容)，摇匀后再用于测定。酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量2. 样品测定包被 每孔加100ml。然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。 37 3h 洗板 放在室温下平衡。用洗涤液洗4次，第一次迅速倒掉并甩干。竞争 a、配标样： 稀释成一系列浓度(2000 ng/ml、1000n

9、g/ml、500ng/ml、250、125、0) 8个。 b、加标样及样品：每个浓度加3孔，每孔50ml， 每个样品重复3孔，每孔50 ml，边缘孔不加。 C、加抗体：每孔加 50 ml，然后将酶标板放入湿盒内开始竞争。 IAA 、ABA， 洗板四人一组2000100050025012562.52000100050025012562.531.250CK根CT根CK叶CT叶31.250CK根CT根CK叶CT叶酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量2. 样品测定加IgG-HRP(二抗 ）：每孔加100 ml，然后将其放入湿盒内， 37下温育30min。 洗板加底物显色：每孔加100 ml(在暗处

10、操作)，然后放入湿盒内，当显色适当后，即0 ng/ml 孔OD490nm为，而本底即完全抑制孔不超过，( 两者之差为1左右 ) 。每孔加入50 ml 23 mol/L硫酸终止反应。 15-20min比色： 用标准曲线最高浓度孔调0，测定OD490nm 计算软件酶联免疫法（ELISA）测定植物激素含量注意事项洗板（低上-高下）时间安排样品吹干真空干燥器-有机溶剂植物的茎尖培养原理 植物细胞具有全能性，即每个植物细胞包含着能产生完整植株的全部遗传基因。从理论上讲，只要条件合适，包含着全部遗传基因的细胞都能分裂分化，产生完整的植株。 在茎尖和根尖的分生组织中一般是无毒或仅含极低浓度的病毒粒子，而较老

11、的组织中，病毒含量随离茎尖距离的增加而提高。根据这一原理采用茎尖组织培养可获得无毒植株。目的和意义掌握茎尖培养的原理和方法植物的茎尖培养实验材料：自己感兴趣的任何植物材料-幼嫩植株初生芽15-20个 实验步骤：1. 配置基本培养基 MS；半天（上午）2. 灭菌 （包括无菌水和器皿） 半天（中午）3. 接种（解剖镜剥离茎尖 接种）（下午）练习使用解剖镜剥离茎尖 植物的茎尖培养1.配置培养基 大量元素：20倍 微量元素：1000倍 EDTA-Fe：200倍 CaCl2H2O：200倍 KI：1000倍 BA： IAA： NAA：肌醇：50mg/L水解乳清蛋白：300mg/L蔗糖：30g/L琼脂：8

12、-9g/L需要自己计算称量的试剂已配母液1、MS（pH）2、3、4、5、6、分组添加植物的茎尖培养1.配置培养基 在制作培养基时，按照以下顺序加入各种试剂：先吸取-，再加入蔗糖，溶解后，加母液，混匀后加蒸馏水，用0.5N NaOH调pH至5.86并用试纸检验。加水定容至所计算体积后，调整pH至。然后将混匀的溶液倾入烧杯中，加入琼脂8g/L，在微波炉上加热融化（如果琼脂质量不好，含杂质较多时，可事先在水中浸泡，清洗后使用）。待琼脂彻底融化后，就可以开始分装。 培养基的分装：将制作好的培养基分装到组织培养用的三角瓶中，分装时，小心地将培养基倒入三角瓶中，以免瓶口沾上培养基容易引起污染。分装量可根据

13、三角瓶大小而定，一般使培养基体积占瓶体的1/4到2/5比较合适。装好后，塞上棉塞，用羊皮纸包严，线绳扎紧，准备消毒灭菌。植物的茎尖培养2.灭菌培养基消毒压力为0.9lkgcm2消毒20min。玻璃器皿及用具、无菌水消毒应适当增加压力和延长时间，一般为，3050min。在消毒用具前，每人应准备好蒸馏水，用棉塞塞好，纸包严，线绳扎紧，同时再准备两套培养皿、皿底内铺两张与培养皿大小相应的滤纸，盖好皿盖，用羊皮纸分别包好，两包合起来，再用一块纱布包好，扎上线绳，一起灭菌。 灭菌121126 灭20min， 放气，2次 植物的茎尖培养3.接种接种室的消毒：材料表面消毒：植物器官(茎尖)用水冲净用70的酒

14、精漂洗材料半分钟放入的升汞中进行表面消毒2-10min用无菌水冲洗材料。茎尖剥离：表面消毒的茎尖和解剖镜都置于超静工作台上。剖取茎件尖时，把茎芽置于解剖镜下，一手用镊子将其按住，另一手用解剖针或解剖刀将叶片和叶原基剥掉。解剖针或解剖刀要常常浸入酒精，并用火焰灼烧，冷却。当形似一个晶亮半圆球形的顶端分生组织充分露出来后，将其切下一般0.11mm（实际操作时可24mm），再用同一工具接到培养基上。接种：每瓶中放置1-3个茎尖放置好材料的培养瓶，立即塞好瓶塞。用一小块锡铂纸包好瓶口；并用线绳或橡皮绳缠两圈结成活头，便于以后解开。记录个人信息。植物的茎尖培养1.配置培养基每人做三种配方，相同配方的同学

15、原则上6人一组配置培养基（pH）400ml每人量取60ml MS培养基，3名同学搭配分别要配置的培养基添加不同激素，分装到3个三角瓶中。32套培养皿（32*3=96）及2L 蒸馏水进行高压湿热灭菌。实 验 流 程母液配制培养基配制培养基等的灭菌接 种培 养外植体表面消毒412356逆境胁迫（盐）对玉米幼苗的影响材料-根、叶片处理-1mol/L NaCl （自选逆境）指标： 激素ABA-IAA(选一) 膜-MDA 渗透物质脯氨酸 保护酶-活性氧代谢-SOD、POD(选一) 几种逆境相关生理指标的测定自己查阅文献，设定胁迫条件（高温、低温、盐害、干旱，等等），或处理材料；自己配制部分药品。任选选3

16、个指标。SOD活性测定（B112）POD活性测定（B112）丙二醛含量的测定（B112）游离脯氨酸的测定（B116）实验仪器：紫外可见分光光度计 离心机二、实验原理 因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。核黄素被氧化物质还原的核黄素氧氮蓝四唑蓝色的化合物（560nm） 2 + 2H+ H2O2 + O2SOD植物组织中超氧物歧化酶活性的测定 实验步骤试 剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750mol/L NBT溶液100mol/L

17、EDTA-Na2液20mol/L核黄素酶液蒸馏水30.60.60.60.60.20.413mmol75mol10mol2.0mol对照管加缓冲液代替酶液总体积6.01、酶液提取 2、显色反应 表1 各溶液加入量，加1ml磷酸缓冲液(pH7.8) 研磨成浆，加缓冲液使终体积为4ml。取23ml于10000rpm下离心10分钟 3、SOD活性测定以不照光的对照管作空白，在560nm下分别测定其它各管的光密度值，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性。 SOD总活性 = 单位：酶单位/g鲜重表示；Ack照光对照管的光密度值；AE样品管的光密度值；V样液总

18、体积（ml）；a测定时样品用量（ml）；W样重（g）；思考题 1、在SOD测定中为什么设暗中和照光两个对照管？2、影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？实验原理：硫代巴比妥酸TBA丙二醛3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮 （三甲川）逆境膜脂的过氧化作用丙二醛酸性粉红色植物组织或器官中丙二醛含量的测定 实验步骤：1 MDA的提取 称2g叶片，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为）及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为MDA提取液。 2 MDA的测定 取1ml MDA提取液，加3ml 27三氯乙酸和 1ml 2%TB

19、A。混和液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却，然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。 结果计算以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(mol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(mol/g FW) D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。注意事项：的三氯乙酸对MDATBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高；MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10

20、-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为0.5 nmolL-1）可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。植物组织中过氧化物酶活性测定原理在过氧化物酶 (peroxidase) 催化下 ,H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在 470nm 处有最大光吸收, 故可通过测 470n

21、m 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。方法和步骤1. 酶液的制备取 2g 材料 , 切碎 , 加适量的磷酸缓冲液（）研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中 , 于 3000g 离心 l0min, 上清液转入 10ml 容量瓶中。2. 过氧化物酶活性测定-l 磷酸缓冲液 ；1.0m12%H202；-l 愈创木酚和 0.1ml 酶液。用加热煮沸 5min 的酶液为对照 , 反应体系加入酶液后 , 立即于 37 水浴中保温15min, 然后迅速转入冰浴中 , 并加入 2.0ml20% 三氯乙酸终止反应 , 然后 , 过滤 ， 适当稀释 ,470m 波长下测定吸光度。计算以每分钟内 A470 变化 0

22、.01 为 1 个过氧化物酶活性单位 (u)。过氧化物酶活性 =(A470 Vt) /（ 0.01WVs t）-1 式中：A470 一 反应时间内吸光度的变化 ；w 一 马铃薯鲜重 (g)；t 一 反应时间 (min)；Vt 一 提取酶液总体积 (ml)； Vs 一 测定时取用酶液体积 (ml) 。植物体内游离脯氨酸含量的测定 原理在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520nm处有一最大吸收峰。脯氨酸浓度的高低在一定范围内与其光密度成正比。1标准曲线制作表 各试管中试剂加入量管 号0123456标准脯氨酸量(ml)00.20.40.81.21.62.0H2O(ml)2.01.81.61.20.80.40冰乙酸(ml)2.02.02.02.02.02.02.0显色液(ml)3.03.03.03.03.03.03.0脯氨酸含量(g)0248121620以光密度值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。步 骤2样品测定（1）脯氨酸提取 取不同处理的材料，分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球塞，于沸水浴中浸提10min。（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液，于沸水浴中加热4