生物分子类试验室常用试验技术原理汇总

1、生物分子类实验室常用实验技术原理汇总一、GST pull-down 实验基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过 SDS电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛 选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达 系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行，操作方便。注：GST即谷胱甘肽疏基转移酶(glutathione S-transferase) 二、足印法(Footprinting )足印法(

2、Footprinting )是一种用来测定 DNA金白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNM段之间的结合。其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被 DNase (脱氧核糖核酸酶)分解，在对目的 DN际列进行检测时便出现了一段无DN际列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核甘酸数目及其核甘酸序列。三、染色质免疫共沉淀技术( Chromatin Immunoprecipitation , ChIP)染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation , ChIP)是研究体内蛋白

3、质与 DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNAW蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合白D DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA勺纯化及鉴定。四、基因芯片(又称 DNA芯片、生物芯片)技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子

4、的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于2cnf的硅片、玻片等支持物上， 构成的一个二维 DN琳针阵列，被称为基因芯片。 基因 芯片主要用于基因检测工作。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序 列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核甘酸的探针。当溶液中带有荧光标 记的核酸序列 TATGCAATCTAG基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确 定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。由臬交位置确定的一组组人楂甘

5、酸探针+杂交探针组*重组的互补序列,TATGCAATCTAGTATGCAATCTAG 轮序列 +基因芯片的测序原理五、高效液相色谱（HPL。高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论， 在技术上，流动相改为高压输送；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中， 就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时, 行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器， 到液相色谱图。然后从检测器的出口流出， 这时整个系统 流经进样器的流动

6、相将其带入色谱柱中进 记录仪将进入检测器的信号记录下来，得六、酵母双杂交（Y2H酵母双杂交系统的建立酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认 识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明，转录激活因子在结构上是组件式的，即这 些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结 合结构域（DNA binding domain,简称为BD）和转录激活结构域 （activation domain,简称为AD）,BD可识别DNA的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游；AD可同转录 曳合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。单独的

7、BD虽然 能和启动子结合，但是不能激活转录，不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激 ；舌转录的功能（如爵母细胞的GH4蛋包的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域 B42融合得到的杂合蛋且仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录）如果诱饵蛋白和靶蛋白能够相互作用，那么GAL4 DNA结合结构 域和GAL4激活结构域就会相互作用，从而激活la cZ报道基因的表达。 所以我们可以通过转化的酵母的表型来确定诱饵蛋白和靶蛋白是否有相 互作用6图5-31酵母双杂交体系原理示意图。(a)GAL4的DA-BD和蛋白质X结合形成的杂 种蛋白，同GAL1的UAS序列结合，但由于没有同AD结合，故不

8、能启动报道基因转 录：(b) GAL的AD同蛋白质Y结合形成的杂种蛋白，没有同UAS序列结合，故不能 启动报道基因转录；通过这两个杂种蛋白中的X蛋白和Y蛋白之间的相互作用， 在细胞内庖建了GAL4M功能，结果启动报道基因进行表达NLPE& P(rK酵母双杂交系统通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报 告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为：1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait),将其与DNA结合域梦合， 构建成诱饵质粒。2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相

9、互作用， 但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基 因的转录；反之，则不能。利用报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质:母单杂交系统的原理用于醉母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研 究表明GAL4的DNA结合结构域靠近残基端，含有几个锌指结构，可激活酵 母半乳楣首酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域可与RNA聚合酣或 转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域要换为其他蛋白，只要他能与 我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可

10、以通过其转录激活结构域激活 RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。酵母三杂交的原理酵母三杂交系统的原理与酵母双杂交相似，利用了酵母细胞的GAL4 蛋白调节目的基因(半乳糖昔酶基因及His3基因)转录的特点，GAL4蛋白 具有两个可分离的功能区，N端是DNA结合结构域，C端为转录激活结构 域.只要这两个相对独立的结构域能够通过一定的方式在空间上足够的靠 近(如借助其他分子的相互结合使其足够靠近)，即使它们之间没有共价结 合也可激活转录，这为9f究蛋白质与其他分子的相互作用提供了可能。七、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源

11、基因随外壳蛋白的表达而表达，同时 ，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬 菌体表面的生物技术。噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体， 然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮5轮的“吸附

12、-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。 所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术是将外源DN A通过基因工程技术克隆到适当的 噬菌体载体上，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣 壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可 保持相对的空间结构和生物活性，然后利用靶分子，采用适当的淘洗 方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶 分子的目的噬菌体：外源多肽或取白质表达在噬菌体的表面而其编 码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出该技术的显著特点是建立了基因型和表

13、现型之间的对应关系n八、RN砥取（Trizol 法）Trizol试剂中的主要成分为异硫鼠酸月瓜和苯酚，其中异硫鼠酸月瓜可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将 RNA!放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNAS入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA离开。水相层（无色）主要为RNA有机层（黄色）主要为 DNA和蛋白质。TRIzol法抽提总RNA组织100mgI加ImITRIzolI匀浆（要彻底，后转至EP管）（组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管）I颠倒混匀10下，室温5分钟（3（TC孵育）I加氯仿1

14、/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）X颠倒混匀15S,室温2-5分钟（30。（3孵育）I4,离心12000g, 15分钟转上层水相（约400ul）于另一 1.5mlEP管中加等体积异丙醇（约400 -500 ）,混匀室温10分钟4,离心12000g, 10分钟（3O*C孵育）I弃上清1加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml4离心7500g, 5分钟弃上清.空气干燥570分钟（不能完全干燥）溶于DEPC水中至20 ul （10。-20打）（可在55-&TC水中，10分钟助溶）实验流程图细胞IJ喀雌 寺悬浮细胞九、RT-PCRRT-PCR是将RNA的反转录（RT和cDNA的聚合酶链

15、式扩增（PCR相结合的技术。首先经 反转录酶的作用从 RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。实验步骤：1、RNA的提取；2、反转录合成cDNA3、PC班增；4、产物的电泳和结果的测定。十、实时荧光定量 PCR(Q- PCR ( Real-time Quantitative PCR )利用荧光信号的变化实时检测PCRF增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。阈值：是循环开始 315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长

16、期。C(t)值：荧光信号(扩增产物)到达阈值时所经过的扩增循环次数。电_ Q-PCR分四个阶段平台明 线性1曾长期指效增长期基线期如何定量? Ct值的概念, Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对 应的循环次数.BCA法测蛋白质浓度MM实验原恻定蛋白质即在碱性条件下蛋白质与 向+络合，并将其还原成Cu1+q Cul+和殖BC A试剂反应，使其由原来的革果绿形成CA （bicinchoninic acidr 二辛J酸）法稳定的 复合物，在562 nm有强烈的光吸收，旦吸光值和蛋白质浓度在 广泛范围内有良好的线性美系，因此可 用于蛋白质浓度测定口方法火敏度时间

17、原理干扰物质说明凯氏定鼠法t Kjedahl ji ）具域值低* i+0.2-1 Omg 期.误差为12，*7。小时将蛋门城转化为 次.用超吸收后淌 定茅景自氯E用 二期乙喂近就 IE白灰的分段J用于标准蛋白般含量的准确漓定 T 扰弧独时大长，司缩睬法(Biuret 江其酸度假 kDOmg中速20-30 分耳城现一限性一广T微色络合物硝酸资TH*舞冲泡:臬些缴暴靛测定快速.但不太 鼠敢：不同蛋白场 显色相似.些外1ftlitt法较为我坡怅K57仆分钟量白原中的酪鼠醴 曲色亘府破M布 2KQnm处晌上暝收各护喋吟引唱荐杵核件酷用卜所梅住流出液 的椅泅；根除的吸 收可以校正。Folin-的试剂法L

18、c* i 法)灵峨度高*5四慢速4a60分钟以割ii就反应；礴出翻一璘鸨酸试剂被Tyr和Ph匕汪跟磁横镇iTris /冲液;甘城底：各种硫附棘费时间长.捷作理尸珞*时；翻色现褪陂不同童 白质菱他考斗斯痛拢法(BratlRird 注)更嫌陵最高1吨快速575分钟而马斯亮独躯耳 蛋白族转台时,其 XmK由465nm变为 EQfnrri强修性携冲液FTrrLcnXlOO;SDS最好的，l it 物战少；颜色熊定； 颜色浅法隔不同生 件质变化.十二、大肠杆菌感受态细胞( E.coli DH5 a )制备1、前夜接种受体菌(DH5或DH10B ,挑取单菌落于 LB培养基中37c摇床培养过夜(约16小时)

19、;2、取1ml过夜培养物转接于 100ml LB培养基中，在37c摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm );3、将0.1M CaCl 2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5、4c下3000 g冷冻离心5分钟；6、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置 20分钟；7、4c下3000 g冷冻离心5分钟；8 、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞 重新悬浮；9 、细胞悬浮液可立

20、即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15%- 20%T油)后超低温冷冻贮存备用(70C)。十三、碱变性提取质粒 DNA碱变性提取质粒 DN蝠基于染色体 DNA与质粒DNA勺变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体 DNA勺氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA勺大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其 pH至中性时，变性的质粒 DNAX恢复原来的构型，保存在溶液中，而 染色体DNA能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNAW不稳定的大分子 RNA蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。十

21、四、目的基因的连接、转化及克隆筛选(1)总过程：分PCR分离目的基因切限制性内切酶切割接目的基因与载体相连转转入宿主细胞筛筛选阳性重组体(2)分PCR分离目的基因：PCR克隆、同源克隆、文库筛选(3)切限制性内切酶切割：粘性末端、平末端(4)接目的基因与载体相连原 理：利用DNA聚合酶反应时都有在 PCR产物的3末端添加一个或者几个 A碱基的特性 和利用T载体3末端的T碱基和PCRT物的A碱基互补配对，经连接酶作用，完成与载体的 连接。2.与T载体直接连接| (1) PCR产物两个3,端一般都有一个A|Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双 链的于端再加上一个多余的核甘酸(优先加A ) 口(2

22、) T载体的两个3,端人为地各加一个T利用T叫DNA聚合酶，当原料中只 有dTTP时，被迫在平端载体上添加T!(5)转转入宿主细胞感受态细胞：经过电击、CaCl2、RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA分子通过时细胞的状态。实验流程感受态细菌（勿动连接产物混匀42（水浴lOOul10ul 冰浴中 30s900涂板加入500pl LB培养液培养过夜,沐浴L2 min 37。（3振荡培养60min（6）筛筛选阳性重组体筛-一筛选阳性重组体 蓝白斑试臆OPTCHXgal试验）原理:基因的调控寿列和除146个氨基酸的编码序列.在褊码序列中插入了一个多克隆位点,不破坏阅

23、读框架,酬E8-T Vector含有编码B-半乳糖替BS基因（LacZ不雄嘀功能.当这种载体转入的宿主细胞是含有B -半 乳糖昔薛逑嫔码序列时，此酶的端序列和端序列可 以互苻（称为。互补），产生具有酷活性的蛋白质（B 一半乳港音BE），从而使宿主细菌在含有IPTC （襄涛导 剂），X-al （生色底物）的培养基上呈蓝色.然而外漏片段插入到质粒的多克隆位点后.破坏原有的阅读檀.此同样请次下，带重组质粒的细菌形成白色藤落.十五、RNAT扰（RNAi）一些小的双链RNA（siRNA）可以通过促使特定基因的mRNA条解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNAT扰

24、（RNAi）。RNA干扰研究的一般流程确定目的基因根据相对应的核酸序列设计出siRNA的序列获得SiRNA用siRNA转染细胞分析RNA干扰的效果十六、cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNAends,RACE)技术是一种基于 mRNAi 转录和PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域 ，从cDNA5进而获得获得全长cDNA3RAC限术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术，成为克隆全长cDNA序列的常用手段。而获得

25、mRNA(cDNA)S整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便效等优点，可同时获得多个转录本。因此近年来RT fth ancfio Reporter Quencher5,荔林忆有加告息团(Reporter. R),髭FAM. VICf3 3玲城记南英光洋天臬团(Quencher. Q):捉针克兔，R所发射的次光能受找Q基团吸收,无臭光，R与Q分开，发绕光Taq鼎力5 -3仆切核改魇话忙，可米解探针FRETMolecule Beacon Principle实时荧光定量PCR的分类一一分子信标三标记荧光的发夹探针三环与目标序列互补X茎由互

26、补配对序列组成实时荧光定量PCR的分类一一分子信标二十四、双分子荧光技术用别互在发目四、双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BIFC)BiFC技术是将荧光蛋白(GFP、YFP、 分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再 与目标蛋白连接。如果力个目标蛋【I因为有 作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片 空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因 出荧光。在发光显微镜下，就能直接观察到 标蛋白是否具有相互作用，对研浣蛋白质相 用有重要意义。7双分子荧光互补技术BiFC双分子荧光互补(bimolecular fluorescence co

27、mp 1 emen La t i on, BiFC)分析技术,利用绿色荧光 蛋白(green fluorescent protein, GFP)及其突变 体(YFP, CFP, BFP)的特性作为报告基因，将荧光蛋白 分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与H 标蛋白连接.如果两个n标蛋白因为有相互.作用而靠 近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠 近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显 微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作 用，并“在最接近活细胞生理状态的条件卜观察到其 相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复 合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的

28、影 响等,这些信息对研究蛋白质相互作用布一定意义。Principle of the BiFC assayAtesorpbcn (NoftuorcscrnctAbsorptionEmlssbriB4fore BiFCAtfterBiFC二十五、酶联免疫吸附测定（ELISA）ELISA是一种免疫测定（immunoassay, IA ）。基础：抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的 酶标记。加入酶反应的底物后， 底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，由此进行定性或定量分析。用于临床检验的ELIS A主要几种类型：落整双抗体夹心法测抗M I常病夹心法二1双抗原夹心法测抗体 间接

29、法测抗体（常用）一竞争法测抗原竞争法工、竞争法测抗体捕获包被法测抗体亲和素生物素ELISA法双抗体夹心法测抗原a忧体史包被特异性抗体洗涤加入待测样品孵肓 洗涤加酶标特异性抗底孵肓 洗海底物显色间接法测定抗体示意图标记的抗体加底物显色间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法。原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的 受检抗体，故称为间接法。寺检抗体+ 肉和抗原1 .包被抗原2 .洗涤3 .加待检抗体4 .洗涤5 .加酶标抗体6 .洗涤7 .加底物显色8 .观察结果。勺。33 : 产。 egoer:血清稀释度 8 6 224 24816326412255110阳性对照阴性对照酶联免疫吸附试验（EL

30、ISA,间接法）竞争法测抗原8 o 待检抗原6 Q g的标记的抗体+ YYYY 上加底物T 显色11M相抗体8检标记的抗原YYYYY Y Y Y固相抗体力山氐物显色(1)将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶 液，使之与固相抗体反应，孵育洗涤。(3)加底物显色：参考管中由于结合的醉标抗原最多, 故颜色最深。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量 越多。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表 受检标本抗原的量。操作步骤：(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗 涤。(2)加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原结 合，形成固相抗原

31、抗体复合物，孵育洗涤(3)加酶标抗体，与固相复合物中的抗体结合，从而使 该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。(4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。捕获包被法测抗体双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAG分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。二十七、mRNA勺分离与纯化（寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA真核细胞的mRN砌子最显著的结本特征是具有 5端帽子结构（m7G和3端的Poly（A） 尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA勺3端存在20-30个腺甘酸组成的Poly （A）尾，通 常用Poly （A+）表示。这种

32、Z构为真核 mRNA勺提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（UJ）琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA勺理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly （A+）的特点，在 RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在 高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液 和蒸储水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。二十八、His-tag纯化蛋白His?Tag序列（6、8或10个连续的组氨酸残基） 与固定在基于 NTA（

33、氮川三乙酸馍）-和IDA- 的His?Bind树脂上的二彳M日离子 Ni2+结合。洗去未结合蛋白后，用咪陛或稍低的pH洗脱并回收目标蛋白。该通用系统使得可在温和、非变性条件，或存在 6M月瓜或尿素条件下纯化蛋白。His-亲合示意图s s S .V n hihih(QCOOHelulian=O=C - C-C O =C=C=C=NQH OH C-COOHMetal Chelate Affinity Chromatography 二十九、RNA 酶保护试验方法 （RNase Protection Assay , RPA）RNA酶保护法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将

34、标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的 RNA样品液相杂交，标记的特异 RNA探针按 碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA;未结合的单链 RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异 RNA探针结合后形成双链 RNA ,免受RNA酶的消化，故该方法命名为 RNA酶保护实验。与Northern blot和RT-PCR比较， RPA有以下几个优点：1,检测灵敏度比Northern杂交高。由于 Northern杂交步骤中转膜和 洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而 RPA将所有杂交体系进行电泳，故损 失小，提高了灵敏度。2,由于PCR扩增过

35、程中效率不均一和反应平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3,由于与反义RNA探针杂交的样品 RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分 降解的RNA样品仍可进行分析。4,步骤较少，耗时短。与 Northern杂交相比，省去了转膜 和洗膜的过程。5. RNA-RNA 杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6, 一个 杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7.检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。 三十、免疫组化 二、免疫组织化学(Immunohistochemistry

36、) 原理七免疫组织化学.即免疫细化.地应用免疫学基本原理抗原抗体反应.即抗原 与抗体特异性结合的原印，通过化学反应使标记抗体的显色制(荧光素、酬.金属离 同位素)显色来确定组织细胞内抗原(的肽和蛋白质).时其进行定位,证性及 定后的研究常用免疫组化塞脸的rr组织石好切片、组织冰流切片,细胞爬片或配 胞涂片 三十一、各种分子标记技术的比较 限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP)可以作为遗传标记，开创了直接应用 DNA多态性的新阶段，是最早应用的分子标记技术。RFLP是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小，反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况，因此DNA序列上的微小变化，甚至1个核甘酸的变化，也能引起限制性内切酶切 点的丢失或产生，导致酶切