(推荐)病理常规切片技术课件

1、病理常规切片技术浙江大学医学院附属第一医院长期稳定的出好片 = 认真做 + 正确的方法 + 能及时发现问题 + 能解决问题 + 制定并严格执行一个完善的规章制度。 HE 切片的注意事项1、固定液的种类、浓度，固定的时间，温度。2、脱水：脱水液浓度，脱水的时间，温度。以及更换试剂的方法。3、透明、浸蜡的温度及包埋时的注意点。4、切片、染色的控制和染色液的更换。5、脱水、透明、封片。谢 谢WWW.D谢 谢固定 固定是技术室工作的第一步，也是在整个制片过程中无法补救的一步。所谓“固定”，就是组织离体后，用各种办法使其细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置的过程。 固定的目的是为了防止组织细

2、胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。另外，组织固定后，均呈一定的硬化状态，增加了组织的韧性，而且不易变形，有利于以后的组织处理。 所以组织一旦离体必需及时固定，固定液的量应为组织的5倍以上。固定的关键主要与固定的及时性、固定液的选择、固定液的浓度、固定的温度和时间有关。最常用的固定液为10中性福尔马林。但由于受到福尔马林的质量、使用时的挥发和取材时带入水分的影响，浓度容易被降低致组织固定不足，而高浓度的福尔马林，降低了对组织的穿透性，形成周围固定好而中央固定不到的现象。所以可以适当的增

3、加福尔马林的浓度，以12-15左右为佳。 固定的时间和温度组织固定的时间12-24小时，组织固定时间越长，抗原丢失越严重，同时也会使组织发硬。组织固定的温度最好在20-30度之间，温度越高，固定越快，但收缩与硬化也更严重。水洗 固定后应该水洗（10-20分钟），这一步通常被很多人所忽视，固定后不水洗，容易造成脱片和染色不鲜艳。也不利于蜡块内抗原的长期保存。脱水 所谓脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来，以利于有机溶剂的渗入，这一过程称为脱水。脱水是否彻底，直接关系到组织是否能充分透明。一般我们总认为脱水主要跟高浓度酒精有关，而忽视了与低浓度的酒精关系 。低浓度的酒精可以减少细胞的收缩，使组

4、织更好切。 脱水的关键是如何使低浓度的酒精脱水时间和高浓度的酒精脱水时间的正确搭配。 其实70-80%浓度的酒精具有极强的穿透力，在短时间内可以置换出大量的水份，而高酒精容易使蛋白质凝固，在组织的表面形成一层硬壳，使酒精难以渗透到组织块中间去，导致组织脱水不佳；其实高浓度酒精里只需脱去从低浓度到高浓度之间的水份，如果在酒精里的时间过久，或在脱水时加温过高（超过36），使用丙酮等等，都容易导致组织收缩过度和组织发硬、发脆。 组织脱水引起的组织发脆有二种原因：一种是组织脱水过度，其现象是切起来组织如粉状或组织特别硬，出现一丝一丝的现象或出现一棱一棱的现象；另一种是假脆，是脱水不足引起的，切起来也是

5、组织硬，也会出现一棱一棱的现象，还会使组织整块整块往外崩，这种现象主要表现在子宫肌瘤和纤维结缔组织多的组织中；严重脱水不足的组织中间发软，甚至还会有水。 为了使组织脱水恰到好处，大小标本应该分开脱水，一般情况下，大标本脱水时间，75酒精1.5小时，85酒精1.5-2小时、95酒精（2道）各1.5-2小时、纯酒精（2道）各1小时。小标本脱水时间应相应缩短。脱水时间长短，与室温高低、固定程度、组织类型、厚薄有密切的相关。纯酒精只需要脱去5%的水份，所以并不需要很长时间。组织在高浓度酒精里随着时间的延长，硬度、脆度也在不断增加。 我们在实践中发现，室温在12-15时，可作为一个临界温度范围。当室温高

6、于此温度范围时，组织容易脱水，可适当缩短脱水时间；而室温低于该温度范围时，应适当延长脱水时间。从规范化角度出发，应该尽可能的减少变量，也就是：温度、浓度和作用时间。如果一年四季都在一个恒定的温度下（35）最好，有条件的应该买全封闭自动脱水机。 更换脱水液，应以量为基础，定量更换。根据我科经验，如试剂用量为500ml，每500个蜡块更换一次为宜。在更换脱水液时，不提倡全部试剂向前退的方法，因为此法不能保证低浓度的酒精的浓度（往往会偏高），可用比重计去测量脱过水的酒精浓度，但由于脱过水的酒精内含有大量的脂肪、蛋白质，比重计不能反映出酒精的真正浓度。 所以我们认为85%、95% 的酒精不能退到前一道

7、酒精里，因为前几道酒精含有大量脂质，第二道的95%酒精可以退到第一道95%的酒精里，第二道无水酒精也可以退到第一道无水酒精里（如果有比重计，第一道酒精加水至95%，如果没有比重计只有倒去）。要保证各梯度酒精的真正浓度。只有这样才能做好每一批组织。 脱水原则： 合理调整各浓度酒精的脱水时间，在最短的时间内，把水份脱干净，使组织收缩最小，硬度最适中，切片最舒展、最好切。透明 为了使石蜡能够浸入到组织块内，必须经过一种既能与脱水剂混合，又能与石蜡相溶的媒介物质，这个过程称透明。目前最好的透明剂是二甲苯。 很多人认为二甲苯极容易使组织发脆，这个观点有点片面，在常温下，如果不是时间过长，二甲苯并不会引起

8、组织发脆，相反会使某些组织结构比较质韧的组织（比如子宫肌瘤等）由于透明充分而变的更好切，但当二甲苯加温后，就极易引起组织发脆。所以二甲苯透明应该控制在室温，30-90分钟为宜。浸蜡 组织透明后，在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。目的为了使石蜡渗透到组织中去。浸蜡温度过高（超过60），在蜡内加入二甲苯或由于透明时带入石蜡的二甲苯过多，都会导致组织发硬，还会使组织内的抗原受到破坏；所以浸蜡用的石蜡熔点应该在54-56左右 。浸蜡用的石蜡如有杂质应该过滤，以防吸入组织内，造成切片刀刀口受损，或切片破碎和划痕增多。 时间：第一道：石蜡15-30分钟；第二道：石蜡60分钟；第三道：石蜡，90分钟以上。浸

9、蜡温度控制在56-58左右。（第一道也可用硬脂酸石蜡1：3混合浸蜡，不仅可软化组织，特别适用于比较韧、硬的组织，而且由于硬脂酸是弱酸性的，染色后核浆比比较鲜明，缺点是容易脱片，疏松组织在展片时容易散开，所以要用后面几道石蜡尽可能将硬脂酸洗净）。 包埋 用包埋剂来支持组织的过程称包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键一是平整，二是方位。要求在包埋时，应采用镊子轻压组织块拱起部份，使之平贴于底部，通常采用组织的最大面包埋。囊壁、管腔组织应竖直包埋。小块多颗组织，应尽量放在一起，并保证在一个平面上，蜡块上下应留有余蜡。 包埋时还应注意有无缝线，纸絮，如有一定要去除。胃黏膜活检标本，不能按一般的规律取

10、最大包埋面，应采取窄长面包埋。 包埋的蜡更应过滤，留有杂质的石蜡，容易造成污染或刀口受损。蜡的熔点应在56-58之间选择，不提倡在冬天使用软蜡。因为用软蜡包埋的蜡块，到了夏天，会粘在一起，不利于资料的保存，而且即使在冬天，用硬蜡包埋的蜡块也比用软蜡包埋的蜡块要好切。切片 切片前要把切片机上有关的螺旋拧紧，并调整好切片刀的角度。切片的第一步必需粗切。粗切的厚度大约在15-30微米左右，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些，粗切致组织全部暴露后，才进行细切。细切至组织块表面均匀一致，无白点后，再把切出的蜡片放入温水中。切片时要求用力均匀、柔和，摇速不易过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，切片难以展

11、开；过慢会使切片增厚。 切片厚度一般为2-3微米。切片的要求是完整、薄、均匀。切下的片膜其大小形状应与组织块一致，切片的不完整，常会将重要病变遗漏，导致误诊、漏诊。在切片放蜡块时，应注意组织包埋的方向，组织的层次，纤维、肌肉等的走向应与切片刀平行，较难切的部分应放在上面，如皮肤的表皮，肿块的包膜，胃肠道的浆膜等，这样可以减少组织的断裂现象。 原因：1、切片太厚2、刀不快，特别是由于肿瘤组织（或切小标本）本非常好刀，所以在刀不快时，切片也非常平整，容易出现此类现象。3、蜡块太冰。 操作切片机时应用力均匀，避免用力过重，减少机器的磨损。在使用毛笔展片时要防止笔丝进入刀口，因为每切到一根笔丝，就会增

12、加一个缺口。切片厚度一般为3-5微米，有人认为：只要切片机刻度标着几个微米，切出来的片子就是几个微米。其实不然，当切片刀不锋利、或切的较慢、蜡块不冰时，切的片子都会变厚；只有在切片刀十分锋利、切片匀速的情况下，才能真正保证其厚度。 经验： A35比R35切片更薄，更平整。 而R35比较连片。 切片机用完后必须每天清扫干净，并用松节油或白油等把机器的表面和各关节擦拭干净。要想保证机器的精确度和延长机器的寿命，重点在于机器的保养，必须养成一个良好的工作习惯。 展片与捞片 展片水温应在45至48之间，这主要和包埋蜡的熔点有关,水温过高，会引起组织细胞散开，水温过低，切片皱摺无法摊平。包埋蜡中如有二甲

13、苯，会造成蜡片迅速溶解。 而用一次性刀片切的片子，一碰到热水，片子上的皱摺就无法再展开，这有二个方法可以解决： 第一、可以在切片时边切边向蜡片吹气，这样的片子就会非常平整，放到热水里就会自然展开，比较方便快捷，但这样的片子会略微厚一点； 第二、在切完片子后，先把切片放在冷水里，再放到热水里就容易展开。也有人把切片放入10-30%的酒精里，让酒精的张力自动把皱摺展开，然后再将切片移到热水，这样的片子会较薄，但容易引起切片破碎，出现裂隙，像脂肪之类细胞间粘附性较小的组织一碰到酒精就会散开，故不是十分完美。 最后捞片时玻片要干净，要选择那些完整、无皱摺的切片，粘贴于玻片中1/3和下1/3的中间。11

14、. 烤片和脱蜡 烤片，一般在60的温箱内烤片1小时左右，温度过高，会引起切片细胞收缩；时间太短(少于30分钟)，容易造成脱片，同时时间太短，切片上肉眼不能见到的水珠没有烤干，会导致脱蜡不干净（水和二甲苯不相融）。脱蜡用的二甲苯要经常更换，一般用2-3道二甲苯，每500ml液体，处理500张切片后更换一次为宜。 当室温低于18时，必须将切片从温箱拿出后立即放入二甲苯中脱蜡，或将二甲苯放入温箱内预热（37左右）脱蜡。然后经高浓度的酒精到低浓度的酒精洗去二甲苯，至水。 染色 染液的配制：苏木素配制非常重要：苏木素液配制的关键在于氧化。 (1) Harrys苏木素：苏木素 1g 无水酒精 10ml硫酸

15、铝钾 20g 蒸馏水 200ml氧化汞 0.5g 冰醋酸 5-8ml 先将苏木素溶于无水乙醇中，备用。把明矾放入蒸馏水，加热溶解，再加入备用的苏木素，煮沸 2 分钟，先加入少量的氧化汞，防止氧化过程中苏木素外溢，玻棒搅拌，然后，边搅拌边加入氧化汞。加完后，立即（关键！冬天可以多烧半分钟）移至冰水中，加速其冷却，静置一夜后，过滤。用前以 5% 的比例加入冰醋酸。如配好后时间较长，冰醋酸的量可适当多加一点。冰醋酸的量，可直接影响苏木素的着色能力和清晰度。加少了，会造成核浆共染，背景不干净；加多了，核着色能力下降。 （2）Gill改良苏木素液（进行性染色） ： 苏木精 2 g 无水酒精 250 ml

16、 硫酸铝 17.6 g 蒸馏水 750 ml 碘酸钠 0.2 g 冰醋酸 15-20 ml 先将苏木精溶于无水酒精,硫酸铝溶于蒸馏水,然后两液混合后加入碘酸钠,最后加入冰醋酸。此液为半氧化进行性苏木素液，染色可以不分化（如果分化效果更好），不会产生沉淀，氧化膜少。 Gill改良苏木素配制重点： 碘酸钠的量： 0.2 g 为25，室温每下降1 ，碘酸钠的量应该增加0.01 g ，但最多不能多于0.3 g 。过多的碘酸钠会使苏木素过氧化。（3）伊红（醇溶性）配方： 伊红 （醇溶性） 2.5 g 95%酒精 1000 ml 加冰醋酸（几滴）至半透明状。 重点：现在的醇溶性伊红都偏酸，应该将pH值调至

17、5.0。 苏木素染色时间要根据染料的新旧、温度、切片的类型而定，一般为515分钟。经水略洗后，用盐酸酒精分化是关键，分化程度必须用显微镜控制。分化水洗后，可用温水或自来水蓝化，并充分水洗（流水冲洗5分钟以上），以防盐酸残留导致切片褪色。我们不提倡使用碱性溶液（释氨水、肥皂水等）促蓝，尽管蓝化效果很好，但从实践的结果来看，用碱性溶液促蓝的切片容易褪色。染液的更换也该应量化，苏木素2000张/500ml，依红4000张/500ml 。 HE染色的关键在于深浅适度，对比鲜明，一般有经验的，肉眼就能判断，但偶而也会出现失误，所以用显微镜控制是最保险的方法。核浅核深浆深浆浅 其关键的步骤在于苏木素染好后

18、的分化及蓝化过程，在蓝化结束后，应在显微镜下观察细胞核着色是否合适，核结构是否清晰，胞浆内是否有残留的苏木素等等。染色理想的切片在显微镜下应是：细胞核与细胞浆蓝红相映，鲜艳美丽；核浆对比明显，核膜及核染色质颗粒清晰可见。 脱水和封片 切片脱水应从低浓度的酒精到高浓度的酒精，80%酒精1道，95%酒精2道，纯酒精2道，二甲苯2道。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水，但也容易使伊红褪色，故脱水时间可短一点，每道13分钟，纯酒精每道510分钟。为增加酒精与二甲苯的相融性，切片更透彻，可在二甲苯前面增加一道正丁醇；石碳酸二甲苯液也有此效，但石碳酸是弱酸性液体，如不洗净，可引起切片的褪色，不利于切片久存，故