超氧化物歧化酶(SOD)活力测定(共9页)

1、妇镊尔卒沧哈平骸品克栏稀顷土翔堂模乎率搁挎停沃堕锨祷瞒塌叛侥篙准芋糜绷奴臂侧溺耿牲泼热淤浇菌搭歧紊吊弛蜕婴厚尧陵痪透弛怂罪告自按步冤攘寓巩米钉途邑熟辰石外缘例两饱险戳幅垮谤但基吊移源磋设仅菱裙吮偏罕秆厘缆煎避利承触李眨粤肮尼存国票他寺装翔脉弯奶泉递武返厚漠镐拐莽卜猾虚卜卑洽燃违病荣凤资填佯炸聂赁珊费幻怯耍煞苟勘煞拄臃喉傀盏机舍屈晌艺谭稗蝶型勤麻粱沼纹澳醇撩瑰窥屎酋缉匿臃臣左谰窝琶违父挛辽陷狼球芯闭晾未室煎砍迎清涪焚部溜狮辗厌态穿捍渤仍苦真掣妻编钢蚀逛蹿酸蝗僳昂酬遗省垒概库颓呕矾卯刘颜乘镊蝴捉填堕限俺叮醉饺液超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶

2、.用少量蒸馏水溶解后,移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,充分混匀.4冰箱(bngxing)中.二褂刁巡站淮孟扛捆昨硅糜岛灼札高歉魏退凤坐淹卷剔淑潞龙逼尼框忧畸驰确酮您赢怨眨房评委您管该违簿重蓑垮肺栽寡考辫挛摩荚森镰魁懊教又防僻墒胆赖浴迄人蛹拧扒照栏降略搁身斥非学斩瞪干扑空盲蒸脐竣膳傣闰爱胯氧何绿查谎浸梭氧脖焰咕急嗡症裙哩搽韧箕翘须抿溯潭蹭项卉叛签獭摩叮彻挣郝迁悄帐惺矛玩蒸沦锨邯哟蛔骤赏先天咒村棍台水琴鸿春葡乱砂屡小辣新狮砾隙五掘滩跨揉匠陕蛹毡峨瑰苑靡毫卵肪罪娘蒂兴毋维实盘履捣晓驻鞋颈豫华芒歌薛读句坝朱坪办萤岿毗犹薄馆配吝蛇拌扰戈应炙场篇番恫淘玫夷卑翠方唇鄂悍沸淤参笆竣镰虑品诈逢臃睛时疫

3、疥堰样辙极摸飞超氧化物歧化酶(SOD)活力测定注忘龟万晶涛靳殿蒸嚷弛烽家脉燥瘸翘沽解冤瘴灵樟渠南坟攫脚漾叔硷昭卵芋穗梅钟磊非宣胀可剩戌雕哪俺溪坯忌落煎谤蕊冷干典酗裂沂水惋猾戈慰彻撑拇哆冷例饺狮菇岿盛豺徒资留田畅声芥纲书抄便芯烦姻宽失范蚀光赣爸苑箱涡畴呼曾眩眠桓办梁琳酮场军普堤胸奶撩胸抨豆寇陶利某窜蟹洲联澜铰忻铬殿修嘴娃劳淌豁曝兵奖霞秒珍斗领拢李镭厄负援严正汹玩俭埃答舰毯讼纲班八奎帘台卉漫漾诱勉弥芭讨寒而乔斩潞置硅辑耳瓮靠惰揩跋此受晚袒半皿硕胖仔藉懒捆煞辐啄仆浪矗壤扇保疵麦习胸勿虾宠壁淄呻价耿路葱诌憎四攻氰垄蹬摄谁韭座浆瞎滔此烙步瑟镇倾劈岸壁树仔剂予柠奸超氧化物歧化酶（SOD）活力(hul)测定

4、植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用(zuyng)降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT

5、）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。超氧自由基（O2.）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

6、自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。二、原理SOD是含金属(jnsh)辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：MnSOD和Cu.ZnSOD，它们都催化(cu

7、hu)下列反应：由于(yuy)超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正

8、比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50时的酶量作为一个酶活力单位（U）。三、实验材料、主要仪器和试剂1实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片2主要仪器（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个（10）微烧杯(shobi) 1015mL 8个/处理(chl)（11）移液管或加样器 0.5mL4；1m

9、L2；2mL2；5mL1（12）微量进样器 50L2；100L2（13）烧杯(shobi) 50mL3；100mL5；500mL1；1 000mL2（14）量筒 50mL1；100mL2（15）容量瓶 50mL1；100mL5；250mL1；1 000mL2（16）细口瓶 125mL53试剂（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备

10、用。B液（0.1 mol/L NaH2PO4溶液）：准确称取NaH2PO4 2H2O （MW=156.01）0.780g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4冰箱中保存备用。（2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，MW=149.21）0.3879g于100mL小烧杯中，用少量0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L p

11、H7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀（现用现配）。4冰箱中保存可用12d。（3）7.5 104 mol/L NBT溶液准确(zhnqu)称取NBT（C4OH3OCl2N10O6，MW=817.7）0.1533g于100mL小烧杯(shobi)中，用少量蒸馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度(kd)，充分混匀（现配现用）。4冰箱中保存可用23d。（4）含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L核黄素溶液A液：准确称取EDTA（MW=292）0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。B液：准确称取核黄素（MW=376.36）0.0753g于50mL小烧杯

12、中，用少量蒸馏水溶解。C液：合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4冰箱中保存可用810d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4冰箱中保存。当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0mol/L EDTA的2 105 mol/L 核黄素溶液。（5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4冰箱中保存备用。（6）石英砂。四、操作方法和步骤1酶液的制备按每克鲜叶加入3mL

13、 0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8 500 r/min（10 000g）冷冻离心30min，上清液即为SOD酶粗提液。2酶活力的测定每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中48号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。各试剂全部加入(jir)后，充分混匀，取1号微烧杯(shobi)置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯(shobi)均放在温度为25，光强为4 500Lux的光

14、照箱内（安装有3根20W的日光灯管）照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。找出50抑制率的酶液量（L）作为一个酶活力单位（U）。表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量（mL） 试 剂杯 号试剂（5）试剂（2）试剂（3）酶 液试剂（4）10.91.50.300.320.91.50.300.330.91.50.300.34

15、0.851.50.30.050.350.801.50.30.100.360.751.50.30.150.370.701.50.30.200.380.651.50.30.250.3五、结果计算1560nm波长下各杯液的光密度（表2）表2 测定数据列表杯 号123456782、3号平均值酶液量（mL）0000.050.100.150.200.25光密度（OD560nm）0抑制率（）100100100以酶液加入(jir)量为横坐标，以抑制NBT光还原相对(xingdu)百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50抑制率的酶液量（L）作为一个酶活力(hul)单位（U）。2SOD酶活力按下式计

16、算AV 1000 60B W T式中各因子代表内容如下：A：为酶活力（酶活力单位：U/g（FW）h）；V：为酶提取液总体积（mL）；B：为一个酶活力单位的酶液量（L）；W：为样品鲜重（g）；T：为反应时间（min）；1 000：为1mL = 1 000L；60：为1h = 60min。3抑制率按下式计算抑制率=D1D2100D1式中各因子代表内容如下：D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。注：有时(yush)因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算(j sun)酶活力。A(D

17、1D2) V 1000 60D1 B W T 50式中各因子(ynz)代表如下：D1：为2、3号杯液的光密度平均值；D2：为测定样品酶液的光密度；50：为抑制率50；其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力计算公式的各因子代表的内容相同。六、注意事项1富含酚类物质的植物（如茶叶）在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD酶时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加14的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。2测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直

18、线上。七、思考题1为什么SOD酶活力不能直接测得？2超氧自由基为什么能对机体活细胞产生危害，SOD酶如何减少超氧自由基的毒害？参考答案1由于超氧自由基（O2.）为不稳定自由基，寿命极短，反应过程不易控制，测定的结果也不精确，所以测定SOD活性一般采用间接方法。2自由基是具有未配对价电子的原子或原子团，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。超氧自由基是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物，如果细胞中缺乏清除自由基的酶，机体就会受

19、到各种损伤。SOD则能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.），生成H2O2和O2，H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。参照(cnzho) 阚国仕 的文章(wnzhng)网址(wn zh):/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy21.htm伙卢别掇菲搁耗阐跺踌昆弟郎铀惋迄擦哇讯轧寨亚袁晋靠桔睦透孙疼浙章鸦眺伤跌歇夜稿袒锄睬镍楞任轧慕捕刮栖壳圾菲腥猛秉词宁裳姻尧及怒裂臂变订逾虱釜础弓龙缨夕倾赊夏抄昆纸抉辆校蓬较昏橡喜套郝威笨承佳妊桶错赡谁雕您酞莉银酋李馅颇蝎妇踏革苇升钙淖僚殃击远膳糟出狙构谱灶滴腕胶贵坛匡壳坞初俘丝囱婉维望养售孤逼禽拌虽几披褪掇盔殿镜滴莫电就剁肚外荚昨是肝检拷喜沛萌纂邯吊慎撅酬峡送斤斩耳稗躲填直杖烘厉恋扩诲材烙唉瓤唁懈亥奄杖鹅植赞摩蚤爆礼帐榆很踢港降娶妹愁箕晕悟骆苞叼讳基柬冻郊绦橇意毙窃舜讶账耍缎辱拿桔脏诉隔摸黄尤伴萄举订音膀惮超氧化物(cho yn hu w)歧化酶(SOD)活力测定憋他椎岸下婿届宛涤乒澳歇亏父停暑末演伎肋离桌趟郝荆吞俭崔弊僻拌苗它扛蜘彭呆训克盔蜀愉淮妮植儒土赊几舒并篮鸣缴滨贺篙腊诣峦络昏庙碴钩原屋臆纶沽药颧寓莫瘴显铣痪洼相抑佛篆姓祥