重组蛋白质表达、复性与纯化ppt课件

1、复旦大学生物化学系 黄伟达， 2005年12月8日于华东理工大学 重组蛋白质的表达、复性与纯化为什么要重组基因表达？ 1. 蛋白质功能研讨 2. 生物制药和疫苗消费 3. 疾病的基因治疗 4. 食品、化工用酶制剂 5. 抗虫、抗逆植物改良 6. 细胞代谢产物的富集基因表达体系及优优势大肠杆菌表达体系蛋白质的复性任务中经常碰到的问题基因表达体系 1. 原核体系2. 真核体系 大肠杆菌 (Escherichia coli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；根本不分泌，易构成包含体(无正确折叠的立体构造)，无加糖等修饰枯草杆菌 (Bac

2、illus subtilis)分泌蛋白质才干强，普通有天然立体构造；无加糖修饰功能，培育液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体其 他乳酸菌 (Lactic acid bacteria)沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞植物细胞/组织哺乳动物细胞/组织酵母细胞可消费分泌型蛋白；有天然立体构造，有加糖修饰功能；可进展染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培育上清多糖浓度高;商品化表达体系： 酿酒酵母Saccharomyce cerev

3、isiae; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母Schizosaccharomyce pombe昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中消费，也可在体外培育细胞中消费蛋白;适宜分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞可进展分泌表达，有天然立体构造，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培育本钱较高植物组织植物可大面积种植，可以廉价大规模消费；转基因植物制造费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分别纯化不方便动物乳腺组织分泌消费有天然立体构造和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分别纯化方便，特别适宜药用蛋白的消

4、费；转基因动物制造破费宏大，实验周期长鸟类输卵管组织分泌消费有天然立体构造的蛋白质到蛋清，产量高，容易储存和运输，分别纯化方便；实验本钱低，豢养费用低；加糖方式能够与人有所不同体系选择研讨基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞多肽药物消费: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 大多数沿用细胞培育产物进展灭毒单抗消费: 杂交瘤细胞工业酶消费: 各种微生物 在大肠杆菌中直接消费有活性的胰岛素 在大肠杆菌中消费人凝血IX因子 在大肠杆菌消费Calcitonin类C端酰胺化短肽 在大肠杆菌中进展蛋白质的糖基化修饰 在酵母中进展与哺乳动物细胞一致的

5、糖基化 在鸡输卵管中进展与哺乳动物细胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表达的Factor IX类因子的活性 在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化有能够以后能做到的事在大肠杆菌中表达重组蛋白质假设目的蛋白质有二硫键并需求正确的立体构造, 尽能够进展可溶性表达;假设目的蛋白质没有二硫键或只用来制备抗血清, 采用包含体表达比较好;假设目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要进展交融表达按蛋白质类型分单纯表达: pJLA系列, 用NcoI/NdeI导入AUG的载体交融表达: 交融各种tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc分泌表达: pel/ompT分泌肽按启动子分lac及衍生的tac

6、 , trc, pac, rac等启动子 IPTG诱导lamda phage PL和PR 启动子 热诱导T7 启动子 IPTG诱导T5 启动子 IPTG诱导ara启动子 阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类pJLA50X系列; pcDNAII; etcpET系列 (T7 promoter, Novagen公司)pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司)pGEX系列 (GST交融表达, Pharmacia公司)pBAD系列 (Arabinose诱导型)常用表达载体pTYB系列 (CBD交融, 可以自我切割, BioLabs)Protei

7、n A GSTglutathione S-transferase CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *协助二硫键构成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫键的构成与SUMO (small ubiquitin-related mo

8、difier) KSI (ketosteroid isomerase) 根本上全部沉淀各种交融蛋白表达载体协助可溶化协助分泌到周质可用亲和层析纯化采用MBD交融采用GST交融采用CBD交融采用thioredoxin交融采用Origami等宿主菌降低菌体培育的速度 温度 (15-30), 降低转速 让表达产物可溶化采用CBD交融 (pET36/37)采用Dsb交融 (pET39/40)采用带pelB/ompT引导肽的载体 (pET12/20/22)采用带MBD交融 (pMAL载体, Biolabs)采用带SUMO交融 (pET SUMO, Invitrogen)让蛋白质分泌到间质去纯化方便: 先

9、用 EDTA/蔗糖 溶液处置, 然后 5 mM MgSO4 洗出His-tag (6-8 Histidine)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)各种用于抗体识别的标志为什么要加 tag ?Biotinylation-tag 100多AA的构造域, 在大肠杆菌中被辨以为生物素化的位点. Promega的PinPointTM Xa-1; Invit

10、rogen的pET104-DEST.未命名 DVEAWLGAR, 被用来和streptoavidin结合 (个人通讯) 未命名 一些病毒外壳蛋白的片段, 破坏细胞膜的构造导致容易进入细胞有前景的特殊用途的tagDTT: intein的Cys 溴化氰: MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease: ENLYFQ G交融蛋白的专注性切割BL21(DE3)/pLysS : 本身表达T7 RNA polymer

11、ase 适用pET系列等带T7启动子的载体M15/SG13009 : 本身表达T5 RNA polymerase 适用pQE系列等带T5启动子的载体BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突变 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变 适宜带thioredoxin reductase的交融表达载体, 协助构成更多的二硫键BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表达BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表达特殊的表达用菌株NovagenStrata

12、geneInvitrogen BioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL重要的原核表达质粒提供商The protein folding ProblemHow to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?透析法: 简单; 但费时, 费缓冲液, 蛋白质量少，浓度不能过高(容易产生沉淀) 快速稀释法: 最常用的小规模复性方法; 但比较费时,费缓冲液, 蛋白质的浓度不能高(容易产生沉淀) 超滤透析法: 比较省缓冲液, 处置量大; 但费时, 要控制好蛋白质浓度凝胶过

13、滤法: 快速, 可反复性高, 不会产生沉淀, 操作复杂一点 亲和层析复性法, 水相二相法, etc包含体蛋白质的复性方法分子伴侣 (Molecular Chaperone)A molecular chaperone is able to transiently bind and thus stabilize an unstable conformation of another protein, thereby facilitating correct folding by preventing misfolding and aggregation.Type I: chaperones whi

14、ch are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide HSP family,GroELS,ect.Type II: chaperones with enzymatic properties accountable for acceleration of rate limiting steps of protein folding PDIprotein disulfide isomerase, PPI peptidyl-prolyl

15、cis-trans isomerase), etc 两种主要的分子伴侣人PDI的构造特征PDI 作用机理 PDI has been shown to catalyze reactivation of non-native proteins without disulfide bonds. This function is independent from the redox/isomerase function, as it has been shown to exist in vitro with several model substrates that do not contain di

16、sulfides in their native structure.Folding assistant/chaperoneTimed addition of PDI to refolding Fab/red.Marcus Mayer et al., BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding ofAntibodies in Vitro, JBC Vol. 275, No. 38, 2000Marcus Mayer et al., BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding ofAntibodi

17、es in Vitro, JBC Vol. 275, No. 38, 2000PPI的作用Proline isomerization is widely accepted to be one of the rate-determining steps in protein folding.The function of PPIis to accelerate the cis-trans isomerization process. Molecular ChaperonCyclophilin Family, 典型的PPIRefolding of HCA IIHCA IIHCA II with P

18、PlHCA II with PPl and CsAP202N mutant with PPIP202N mutantReactivation was initiated by rapid dilution of 0.3 M GuHCl and a protein concentration of 0.025 mg/ml (0.83 ,uM). PPI: 9.6M ; CsA: 25M表达量不够高；包含体在8M尿素中不能溶解；重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量偏小；带His-tag重组蛋白不吸附到Ni-chelating树脂上；Ni-chelating分别纯化的效果不好；GST交融蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；包含体来源的采用透析法或稀释法复性时全部沉淀；Ni-chelating错用DTT后发生黑色沉淀该怎样办？贵重的亲