表面微生物监测(共9页)

1、表面(biomin)微生物监测除了用空气(kngq)微生物取样来监测生产环境的微生物污染水平外，表面监测也可监测生产区域表面以及设备与产品(chnpn)接触表面的微生物世。监测的方法必须考虑取样的准确性和代表性。基本的监测方法包括接触碟法、擦拭法以及表面冲洗法。每种提供的数据都可以用于 产品质量的评价。测试方法可以定性和定量。而且取样的准确性受收集和处理样品的过程 影响，因此必须对取样进行培训和测试。接触碟法接触碟容易操作而且可以定量。因此被广泛使用，适用于对平整的规则性表面进行取 样监测。通常的碟子是50mm直径的，培养基充满碟子并形成圆顶，取样面积一般约为 25cm2。培养基可以根据使用添

2、加中和剂。取样时，确保全部琼脂表面与取样点表面充分 接触。取样后，需用蘸有70%乙醇的纱布擦拭被取样表面，以除去残留琼脂。将取样后并 做好标记的接触碟置于培养箱中培养，读数，记录。缺点：不适用于非常规表面；若培养基太湿润，菌落会连片生长导致不易计数。擦拭法该方法通常用于对不规则表面（尤其是设备表面）进行取样。拭子通常为一根棒状 物，其顶端由吸水性材料制成，拭子头在取样前应先行浸湿（通常为无菌生理氣化钠溶液 或0. 1%的蛋白胨溶液约5ml),取样时，握住拭子柄，以30角与取样表面接触，缓慢并 充分擦拭，取样面积25cm2左右（可用特定的无菌模板确定擦拭面积），然后将取样头折 断放入上述溶液内，

3、充分振荡，再用平皿涂布法或铺平板法计数。如果拭子头的材料为藻 酸钙，则要用稀的盐溶液作为稀释剂（如1%柠檬酸钠溶液），这样才能让拭子头完全溶 解。因擦拭取样的面积一般约为25cm2，故擦拭法也属于定量检测方法。缺点：取样和转移技术可能会影响结果；样品处理后才能培养。表面冲洗法该法适用于监测大面积区域内表面的微生物含菌量，包括设备轨道、储水罐等。用定 量的无菌水冲洗表面，收集淋洗水，用膜过滤法来计算微生物数量。缺点：适用性不广，需要额外的操作，取样和处理过程可能会影响结果。人员卫生监测人员是无菌生产中主要污染源。对于无菌药品的人员要求参见“4人员”。人员卫生监测的方法与表面微生物监测方法中的接触

4、碟法相同。培养(piyng)基及培养条件环境监测用培养基的类型和培养条件取决于所选用的检测(jin c)方法，但必须具有广谱性。 通常，营养琼脂（NA)或大豆(ddu)胰蛋白胨琼脂（TSA)培养基属于全能型培养基。此类培 养基适用于多数环境微生物（包括真菌）的分离生长。但是，对专用于酵母菌分离生长的 特定培养基，仍应另行选择，如玫瑰红钠琼脂、萨布罗（Sabourauds)培养基等都是常用 的真菌培养基。如果被监测环境中使用过消毒剂或存在抗生素，则要向表面监测用培养基 中加一些添加剂（聚山梨酯80、卵磷脂、偶氮凝集素或(3-内酰胺酶等），以中和或尽量 减少消毒剂或抗生素的抑菌作用。例如，在对非抗

5、生素生产级区环境设施表面监测时，通 常是在营养琼脂或大豆胰蛋白胨琼脂培养基内添加0.7%的聚山梨酯80和0. 1%的卵 磷脂。应对环境监测用微生物培养基进行验证，验证其在适当的时间和温度条件下检出真菌 (包括酵母菌和霉菌）和细菌的能力。用于环境监控的培养基，首先应检查其可靠地恢复微生物生长的能力。所有配好的培 养基批号，均应进行培养基灵敏度试验，表14-4列出了环境监测用培养基灵敏度检查菌 种。必要时，应使用中和剂，防止洁净室消毒剂或产品残留（如抗生素）抑制微生物生 长。培养基灵敏度检查试验中，可加人环境监测中分离的菌株进行试验，接种量应不超过 100个菌。培养基相关的其他内容，参见“15.6

6、培养基”。表14 -4推荐环境监测用培养基灵敏度检查菌种分类菌 种菌株号箔氧菌祜草芽孢杆菌(Bacillus suhtUis)CMCC (B) 63 501ATCC 6633金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus )CMCC (B) 26 003ATCC 6538铜绿假单胞菌(Pscudomonas aeruginosa)CMCC (B) 10 104ATCC 9027环境监测中分离的菌株厌氧菌生抱梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC (B) 64 941ATCC 11437 ATCC 18404真菌白色念珠菌（Candida albicans)CM

7、CC (F) 98 001ATCC 10231黑曲疮(Aspergillus niger )CMCC (F) 98 003ATCC 16404一旦选定培养基，需确定培养温度和培养时间。通常，需氧菌应在30培养 48 72小时。酵母菌和霉菌数通常在20-ZSt,培养57天。监测(jin c)方法的确认方法确认的手段包括(boku)以下几种。进行(jnxng)回顾性验证/确认，即回顾环境监测的历史数据，并对这些监测数据的重现 性予以评价。參进行挑战性试验，证明监测方法的回收率。该法应用广泛，也可作为回顾性验 证/确认的支持性资料。进行监测后取样点的清洁消毒效力测试。对接触碟法和擦拭法，有时同样需进

8、行方法确认。方法是，将从环境中分离到得代表 性微生物，接种于无菌的试验表面，接种量不超过100CFU，然后按常规方法进行取样及 处理，计算回收率。用于接种的试验表面通常为方形或圆形薄片，材料多为塑料、玻璃和 不锈钢类，以尽可能模拟实际监测时的环境设施表面。通常可以采S引用相关文献或技术 报告的方法来证明该取样方法的适用性。在方法确认阶段，应对培养基、培养时间和培养温度等进行评估，以确定适于环境中 代表性微生物的最佳培养条件。同时，应确定适用于真菌、厌氧微生物或特定的控制性微 生物（指可能严重影响环境的微生物）的选择性培养基。一旦培养基供应商、接触碟、拭 子或监测方法发生变更，则需重新确认。如果

9、决定变更取样方法，变更前必须进行相应的 验证/确认性试验，以保证新方法等效或优于现行方法。取样计划【背景介绍】环境监测的取样计划在各生产企业各不相同，这取决于一些影响因素，包括但不局限 于产品的类型、生产过程、设施/工艺的设计、生产密度、人为干扰、环境监测历史数据 等。没有一个单独的取样方案适用于所有的监测。环境监测的频率及取样fi,最好能及时 发现所有人为干预、偶发事件及任何系统的损坏。由无菌工艺生产的无菌产品与最终灭菌 处理的无菌产品相比，前者的环境监测尤为重要。取样计划应随着取样频率的变化而变 化，根据趋势分析对取样点数量做出相应的调整，既可增加，也可减少。【技术要求】根据生产环境对产品

10、污染风险的高低，确定取样计划。例如，对无菌工艺产品的A级 区取样频率可设为每批一次；I)级区的非关键辅助区取样频率可设为每季度一次。【实例分析】表14-5某公司(n s)无菌药品不同生产用洁净环境的常规取样频率和监控项目（仅供参考)监控区（洁净度级别监控频率监控项目最终灭菌产品 生产区域称擞配料、配液 (以C级区为例）每月一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物灌封间 (以C/A级区为例）每周一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物轧盖间、洗塞间 (以C/A级区为例）每月一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物容器

11、精洗区 (以D级区为例）每季度一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物非最终 灭菌产品 生产区域称傲配料、配液 (以C/A级区为例每周一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物无菌灌封辅助区 (以C级区为例）每周一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物无菌潲封间 (以B/A级区为例）每批一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物 操作者手套和操作服表面微生物微生物实验室无菌实验室 (以B/A级区为例）每次实验空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物 操作者手套和操作服表面微生物限度检查实验室(以C/A级区为例）每周一次空气悬浮粒子 空气浮游菌

12、 空气沉降菌 表面微生物 操作者手套表面微生物抗生素效价测定室 (以D级区为例）每月一次空气悬浮粒子 空气浮游菌 空气沉降菌 表面微生物注：（1每月一次。14.3.4取样(qyng)点及取样量的设置 【背景介绍】取样位点的选择很大程度上取决于洁净室的设计和生产过程。在选择取样点时，应对 每个程序仔细认真地加以评估。取样的主要的目的是提供有价值并可用于判断的数据(shj)，以 便鉴别/识别特定程序、设备、材料和工艺相关的实际或潜在的污染(wrn)。取样应设在如果取 样点受到污染，则产品很可能受到污染的那些位置，然而，必须谨慎地确定取样点的位 置，靠近产品但不要接触产品。【实施指导】常规监测取样位

13、点应考虑如下因素：在哪些部位的微生物污染，最可能对产品质量造成不良影响？在生产过程中，什么地点最容易长菌？取样点的选择需要统计学设计（例如，按照美国标准209E来计算）还是根据网 格法来确定？在常规监测中，有一些点需要周转取样吗？哪些地方是清洁、消毒或灭菌时最难覆盖/接触或最难奏效的部位？什么活动会导致污染的扩散？參在某一部位的取样操作，足以导致测试数据的差错或污染产品吗？取样只应在生 产结束或换班时进行吗？为了建立常规的取样位点，必须考虑产品与其接触或暴露的环境的程度。对反映产品 的微生物污染水平有代表性的取样点必须取样和进行环境监测。与产品接触的来源可能包 括压缩气体，房间空气，生产设备，

14、工具，关键表面，储存容器，传送带，手套，人员以 及水。不与产品直接接触的来源可能包括：墙，地，天花板，门，长発，椅子，测试仪器 和缓冲间。但是，最关键点的位置作为取样点并不一定适用。必须考虑环境监测是否实际上会加 大产品污染风险的概率。此外，如果在生产过程中污染的概率很低，就不必要对关键点取 样（例如，不再需要手工操作的已灭菌部件）。确立一个合适的取样点需要考虑很多因素，比如厂方设施，生产线的设定，验证数 据，生产过程，历史数据，测试方法等。洁净区（室）监测中的取样点和取样量可以比洁净级别确认时的取样点和取样量少， 应该通过正式的风险分析研究和对监测结果的分析（至少要有6个月以上的运行数据作为

15、 分析基础），来确定监测频次和限度。同时，监测频次和限度的确定也要考虑到生产工艺 因素，监测限度及取样点应该定期进行回顾验证，以保证监测行为的有效性。国标 GB/T 162922010、GB/T 162932010 和 GB/T 162942010 医药工业洁净室 (区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法(fngf)中规定了最少采样点的数目。最少采样点数 目可在以下两种方法中任选一种。(1)利用(lyng)公式计算N,=AS最少采样(ci yn)点数(四舍五人为整数）；-4洁净室或洁净区的面积，m2。注：在单向流悄况下.面积/!可以认为fi垂直于气流方向上的横截面面积。(2)最少采样点数可从表

16、14-6查到。表14-6洁净区空气悬浮粒子、浮游菌及沉降菌的最少取样点数面积（m2)洁净级别10010000100000102-322彡 10 20- 40822多 40 1001642彡 100- 20040103200- 40080206400- 10001604013彡 1000 200040010032彡200080020063注：此表摘自GB/T 162922010医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法。环境取样在遵循最低取样点数的同时，还须执行以下规则。空气悬浮粒子參任何洁净区内取样点应不少于两个；除受洁净(jijng)区的设备限制外，取样点应在整个洁净区均匀布置；在一个区域内应最

17、少取样(qyng)五次，每个取样点的取样次数可多于一次，不同取样点的 取样次数可以不同；为了确定A级区的级别(jbi)，每个采样点的采样量不得少于丨m3。參取样点一般布置在距离地面0. 8 1. 5m之间或操作平台的高度；參尽量避免在回风口附近取样，而且测试人员应站在取样口的下风侧。空气浮游菌參除受洁净区的设备限制外，取样点应在整个洁净区均匀布置。在日常监控时，那些与产品相邻近的区域，以及可能与产品直接接触的空气及设 备附近均应考虑增加取样点和取样次数（与产品非接触区相比，这些区域应视为 关键区h人员活动频繁或人员较集中的区域也应被视为关键区，需加强监控。參取样点一般布置在距离地面0. 8 1

18、. 5m之间或操作平台的高度。取样时，取样设备会对气流产生干扰，因此，动态测试空气浮游菌取样时应避免 可能对气流组织的干扰。參应根据被测区域的浮游菌控制限度和取样方式确定取样量，每个点一般采样一次。尽量避免在回风口附近取样（距离lm以上），且测试人员应站在取样口的下风 侧，并尽量少走动。沉降菌测试取样点的分布及其取样位置与空气浮游菌监测相同；日常监控可以根据风险分析 结果，沉降菌与浮游菌交替或混合取样。參沉降时间至少为半小时，但不得超过4小时。表面微生物测试表面微生物监测的取样点数应依下列因素确定：參洁净区（室）的大小；设备、管路等的复杂程度；參生产活动的重要性；參易受污染的部位等。应考虑包含以下部位：每扇门、每个门把手、地板（至少两点）、墙壁（不易被清 洁/消毒的部位，至少两点）、公用介质的管路（不易被清洁/消毒部位）、生产设备的关 键性部位（如灌装针、易与人员接触的塑料帘膜、胶塞筒、传输带）等。根据洁净区内设施、设备等表