蛋白的分离纯化

1、一、蛋白质的分离纯化(chn hu)概述共六十五页与蛋白质分离纯化(chn hu)相关的理化特性分子大小分子形状带电特性溶解特性与配体特异性结合不同吸附性质(xngzh)变性和复性哪些技术、原理共六十五页分子大小(dxio) 重点大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目。常用方法(fngf)透析超滤凝胶过滤离心共六十五页分子(fnz)形状 重点形状：蛋白质在离心通过溶液、膜、凝胶颗粒或电泳凝胶中的小孔运动(yndng)时，都会受到它的形状的影响。方法密度梯度离心电泳 分子筛层析（三格写，两格不写）共六十五页电荷(dinh)原理：蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所

2、带正、负电荷总和。方法(fngf)电泳离子交换层析共六十五页溶解度原理：由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同，因此在溶剂(rngj)中的溶解度不同。方法：盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法共六十五页配体特异性结合(jih) 重点 原理：将具有亲和结合的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，来分离另一个分子。分类免疫亲和层析生物(shngw)亲和层析金属螯合亲和层析拟生物亲和层析共六十五页吸附(xf)性质原理(yunl)：根据次级键相互作用。方法：吸附层析共六十五页变性(binxng)和复性原理：蛋白质在一定的理化条件下失去原有的空间结构、生物学功能及部分理化特性等称为(chn wi)变性。

3、当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性。方法：尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白共六十五页二、蛋白质的分离(fnl)纯化共六十五页细胞破碎蛋白溶解酸、碱醇去垢剂尿素粗 提沉淀相分离分子筛精 提各种色谱电泳分离差速离心研磨超声渗透压酶保 存预处理（沉淀）原材料的获取浓缩(nn su)保存状态保存条件保存期限分离(fnl)纯化流程纯化共六十五页分离纯化流程(lichng)预处理（沉淀、粗分离）-纯化（离子交换）共六十五页机械方法(fngf)：搅拌、振动研磨压滤超声匀浆非机械方法(fngf)：干燥渗透压冻融酶细胞破碎共六十五页体积(tj)离子强度 pH温度蛋白质的稳定蛋白(dnb

4、i)的溶解共六十五页蛋白质的粗分离(fnl)使用(shyng)蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀(重点)、透析、超过滤、蛋白质结晶等。共六十五页蛋白质的纯化(chn hu)粗分离(fnl)只是使蛋白质得到浓缩和初步分离(fnl)纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。常用的实验技术：层析（离子交换等）和电泳共六十五页1. 离子交换(l z jio h

5、un)层析固相支持物：纤维素、琼脂糖、葡聚糖等高分子聚合物带电基团(j tun)：羧甲基、二乙基氨基等平衡离子：H+, Na+, Cl-, OH- 共六十五页基本操作过程(guchng)样品制备(zhbi)，装柱与平衡上样（样品溶解于A液中）洗脱：穿透峰，洗脱峰收集、鉴定共六十五页离子交换层析有两种洗脱(x tu)方式分步洗脱：用间断地递增的不同离子强度的流动相分次洗脱样品蛋白的方法；梯度洗脱：连续改变流动相离子强度的方法。目前随着层析的自动化，梯度洗脱成为大多数情况下的首选(shu xun)方案。共六十五页2. 凝胶过滤(gul)层析利用分子量不同的蛋白质，通过凝胶分子筛时速度不同来分离蛋白

6、质的方法(fngf)。常用的凝胶有Sephadex、Sepharose、Sephacryl、Superdex等。共六十五页3. 亲和层析以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗原与抗体，激素与受体，糖与凝集素等。将上述作用体系的一方(y fn)连接到层析基质上，使之固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方(y fn)。共六十五页各种( zhn)用于抗体识别的标记His-tag (6-8 Histidine)镍离子-6个组蛋白T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)V

7、SV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)共六十五页免疫亲和层析：将蛋白质抗体偶联到免疫亲和柱可用于抗原(kngyun)蛋白的纯化；凝集素亲和层析：凝集素是一大类能专一性和糖类和糖复合物结合的蛋白质，固定化凝集素可用于糖蛋白纯化；染料亲和层析：有多种染料可与各种类型的酶结合，又不受酶的作用，可用于多种蛋白的分离。亲和层析中的三大通用(tngyng)技术共六十五页电泳(din yn)（electrophoresis）带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电极移动的现象称为电泳(din

8、 yn)。蛋白质在电场中泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相反的力的作用蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流电场中泳动速度不同。共六十五页常用(chn yn)蛋白质电泳技术聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）等电聚焦(jjio)电泳（ Isoelectric focusing- IEF）双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）共六十五页聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（bis）经共聚合而成，此过程(guchng)在TEMED和过硫酸铵催化下聚合成网状结构的凝胶。凝胶的孔径可在较宽范围内变化，

9、以迎合不同的分离需要。共六十五页根据凝胶的均匀性（孔径、pH）可分为连续与不连续两类；根据是否加蛋白质变性剂，可分为变性与非变性两类；根据是否加还原剂2-巯基乙醇或DTT，可分为还原与非还原两类；还可根据电泳装置的不同(b tn)，分为圆盘电泳和平板电泳。PAGE的分类(fn li)共六十五页不连续平板PAGE，是使用 最广泛(gungfn)的蛋白质电泳技术，它由浓缩胶与分离胶两部分组成。不连续PAGE有很高的分辨力，因为它有以下三种效应：浓缩效应电荷效应分子筛效应不连续(linx)PAGE共六十五页染色法：考马斯亮蓝染色法（多种类型可选）、银染法；活性检测法：适用于Native PAGE，其

10、中蛋白质保持天然活性，可用酶学方法检测；免疫(miny)印迹法：用特异性抗体检测蛋白质的技术。PAGE的检测(jin c)方法共六十五页2. 等电聚焦(jjio)电泳根据蛋白质的等电点进行分离的一种技术。基本原理：利用两性电解质载体形成一个连续(linx)而稳定的线性pH梯度，使pH从正极到负极逐渐增加。蛋白质分子在偏离其等电点的pH位置带电，因此在电场中可以移动；当蛋白质移动到pH等于pI位点，其静电荷为0，在电场中不再移动，据此可将不同pI的蛋白质分离。共六十五页优点样品加样位置和体积不受限制；分辨率高于其它(qt)类型电泳；可测定pI值；缺点样品在pI区域易沉淀，为增加样品溶解度，可以在

11、胶中加入尿素，但导致蛋白质失活；样品前处理麻烦。等电聚焦(jjio)的优缺点共六十五页3. 双向电泳（概念(ginin)、原理、作用、用途）将等电聚焦技术与SDS技术组合起来的新技术，是目前分离(fnl)蛋白质混合物最强大的技术，也是蛋白质组学研究的重要技术。基本步骤：第一相等电聚焦后，在等电聚焦的垂直的方向进行第二相SDS。双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。共六十五页应用凝胶中蛋白的检测图像采集(cij)和分析蛋白鉴定分离蛋白质组所有蛋白共六十五页（1） IEF等电聚焦(jjio)电

12、泳（2）SDS（3）染色(rns)脱色pH 3 - - - - - 10共六十五页图像(t xin)分析在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时，需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，以寻找(xnzho)差别表达蛋白。常用的软件如安玛西亚公司的Image Master 2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。共六十五页蛋白质的浓缩(nn su)超滤法冷冻干燥法沉淀法共六十五页三、蛋白质的鉴定(jindng)1. 蛋白质的含量测定2. 蛋白质分子量的测定3. 蛋白质免疫印迹技术共六十五页蛋白质的含量(hnling)测定目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总

13、蛋白含量；目前没有任何(rnh)方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；最常用的蛋白定量方法是凯氏定氮法， Lowry Folin法、考马斯亮蓝法、紫外分光光度法等。共六十五页3. 蛋白质分子量的测定SDS测定分子量凝胶过滤(gul)层析法测定分子量质谱法共六十五页1. SDS测定(cdng)分子量基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例(bl)（1g蛋白质结合1.4g SDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。共六十五页2. 凝胶过滤(g

14、ul)层析法测定分子量蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示： lg MrK1K2 Ve在实验中，只要测得几种(j zhn)蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。共六十五页SDS与凝胶过滤法是互补(h b)的凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS测得的是蛋白质亚基的分子量；在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到(d do)待测蛋白质结构的许多信息。共六十五页质谱法是最精确(jngqu)的分子量测定方法质谱（

15、 Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱(tp)。测定蛋白质分子量的精确度为0.010.1。共六十五页4. 蛋白质免疫印迹技术 ( 重点(zhngdin) 必须掌握）共六十五页印迹(yn j)法的基本原理印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过(tnggu)不同途径转移到固相载体上的过程。与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。共六十五页目前(mqin)常用的印迹法： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 重点共六

16、十五页蛋白质印迹(yn j)的用途用于检测样品中是否有特定蛋白(dnbi)的存在，并进行半定量分析。共六十五页Western blotting原理(yunl)图示共六十五页原理(yunl)（问度娘）Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影

17、以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术(jsh)也广泛应用于检测蛋白水平的表达。共六十五页共六十五页基本(jbn)操作步骤样品的制备细胞(xbo)裂解物的SDS蛋白质的转移目的蛋白的检测共六十五页印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。为减少非特异性干扰，需对固相载体进行处理，即用一种与待测物不反应的物质如蛋白质、核酸、吐温20等封闭载体上印迹以外的剩余(shngy)吸附点（该过程称为封闭），使探针仅与印迹物起反应，且不吸附到载体上。共六十五页膜种类(zhngli)硝酸(xio sun)纤维素NC膜PVDF膜尼龙膜共六十五页膜的特点(tdin) 共六十五页转膜方

18、法(fngf) 重点半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样(yyng)加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 共六十五页电转仪共六十五页转膜后检测(jin c)丽春红S染色蛋白带出现(chxin)后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。共六十五页探针是用化学方法将能与待研究(ynji)蛋白质结合的物质如抗体，与某些标示物如酶、同位素或荧光物质、半抗原等结合形成的复合物。蛋白质印迹最常用的探针是酶联抗体（HRP酶或AP酶）。共六十五页两种常用检测(jin c)酶系统的比较共六十五页内参(ni cn)的选择原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差(wch) 种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 共六十五页化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染(hunjng wrn)、半衰期短荧光底物法： Krypton 荧光底物共六十五页抗体(kngt)的