医药-临床-护理心力衰竭衰竭的实验研究ppt课件

1、欢迎进入学习 课堂心力衰竭的实验研究(Experimental Study of Heart Failure)病理生理学教研室 刘 洁心力衰竭时整体、器官、细胞和分 子水平的改变及其病理生理学意义利用基因敲除或转基因技术研究特 定基因或基因表达产物的功能心力衰竭研究的基本策略(Basic Strategies for Heart Failure Study)一、传统心力衰竭动物模型二、基因改造的动物模型三、分离培养的心肌细胞四、干细胞与心肌梗死的治疗Contents（Conventional Animal Models of Heart Failure）一、传统心力衰竭动物模型心 肌 受 损

2、( Impaired myocardium ) 心室负荷过重(Overload of ventricle) 其 他 ( O t h e r s ) 心 力 衰 竭 的 病 因(Causes of heart failure) Classification（一）冠状动脉结扎模型（二）压力超负荷模型（三）容量超负荷模型（四）心动过速起搏模型（五）其他模型（一）冠状动脉结扎模型（Coronary Ligation Models）大鼠、狗、家兔Establishment结扎左侧冠状动脉Suitable Animal心肌缺血缺氧心肌代谢异常心 力 衰 竭心 肌 梗 死心 肌 受 损舒缩功能障碍 结扎左侧

3、冠状动脉不完全结扎：慢性心肌缺氧导致HF完全结扎：心肌梗死导致HF（二）压力超负荷模型 (Pressure Overload Models)主动脉缩窄模型 (Aortic Banding Models)高血压模型 (Hypertension Models)1.主动脉缩窄模型（Aortic Banding Models）缩窄主动脉Establishment左心室射血阻抗 左 心 衰 竭左心室压力负荷过重主 动 脉 缩 窄腹主动脉缩窄：大鼠、家兔胸主动脉降枝缩窄：豚鼠Suitable Animals2. 高 血 压 模 型 (Hypertension Models)自发性高血压大鼠(SHR) (S

4、pontaneously hypertensive rat)两肾一夹肾性高血压大鼠 (Two-kidney one-clip renal hypertension)左心室射血阻抗 左 心 衰 竭左心室压力负荷过重高血压外周阻力（三）容量超负荷模型（Volume Overload Models） 狗 ：建立动静脉瘘或破坏二尖瓣家兔：主动脉瓣穿孔导致主动脉返流大鼠：腹主动脉与腔静脉间造瘘Establishment左 心 衰 竭左心室舒张期容量负 荷 过 重破 坏 二 尖 瓣二尖瓣关闭不全主动脉瓣穿孔主 动 脉 返 流（四）心动过速起搏模型（Tachycardia-pacing Models）狗：起

5、搏心率200 次/分家兔：起搏心率350400 次/分Establishment心 力 衰 竭心 输 出 量心 动 过 速心 肌 耗 氧 量心室充盈不足缩 短 舒 张 期（五）其他模型（Other Models）心 肌 病心 肌 损 害心肌舒缩功能障碍心 力 衰 竭 心肌病：阿霉素心肌病 心肌病仓鼠整体水平研究器官组织水平研究细胞分子水平研究Applications 可对心力衰竭发生发展的全过程进行研究，包括代偿期、从肥大到衰竭的过渡期、心肌重构过程以及轻中度心力衰竭。AdvantagesLimitations动物种属差异很大，不同模型与心力衰竭病人的某些方面相似在动物模型所得结果与心力衰竭病

6、人不完全相同细胞类型与刺激因素多样而复杂（Gene-modified Animal Models of Heart Failure）二、基因改造的动物模型研究心力衰竭的相关基因研究心力衰竭发生发展的分子机制Applications（一）基因敲除模型（Gene Knockout Models）Cardiac-specific “Knock-out”PMHC drives Cre recombinase expression. Cre recombinase catalyzes the recombination at a specific DNA sequence(named loxP site

7、). If a target gene is “floxed” by two loxP sites by gene targeting , Cre recombinase works as molecular scissors to cut the target gene out in a cardiac-specific manner, as Cre is expressed only in the cardiomyocytes.1. 肌肉 LIM 蛋白基因敲除小鼠（Muscle LIM Protein Gene Knockout Mice） 肌肉 LIM 蛋白调节肌肉分化，敲除其基因的纯合

8、子将发展为扩张性心肌病，伴心肌肥大、间质细胞增生和纤维化，成年小鼠出现心力衰竭。（ Myogenic Factor 5 Gene Knockout Mice ）2. 肌肉因子 5基因敲除小鼠 Myogenic Factor 5参与肌细胞的增殖与修复，敲除其基因的小鼠将发展为扩张性心肌病。（二）转基因模型（Transgenic Models）Cardiac-specific Transgenic SystemA promotor region of a gene defines time- and tissue-specific expression of the gene. Cardiac M

9、HC gene promotor (PMHC) drives expression of the gene in a cardiomyocyte-restricted manner. A foreign gene connected to PMHC is expressed in the transgenic mouse in the same pattern as cardiac MHC .1. G蛋白转基因小鼠（G protein transgenic mice）(1) Gs 转基因小鼠（ Gs Transgenic Mice ）过表达Gs慢性持续性交感刺激心 肌 病心 力 衰 竭心脏过表

10、达Gs的小鼠基因转录：心脏GsmRNA增加38倍蛋白含量：Gs含量增加3至5倍蛋白功能：Gs活性上升88%左室射血分数 (EF) 正常-AR激动剂与受体亲和力增强AC活性增加心肌对Iso和NE敏感性增加出 生 时 心肌病、心脏扩大、左室EF下降1 4 个 月 后 病理检查心肌纤维化心肌细胞数量减少残余心肌细胞代偿性 肥大、变性与萎缩(2) Gq 转基因小鼠（ Gq Transgenic Mice ）2 倍表达：无明显变化4 倍表达：心脏重量增加，PKC的膜转 位增加，胎儿基因表达增加， 心肌收缩力减弱更高表达：动物死于左右室衰竭和肺淤血小鼠心脏中过表达Gq 结扎主动脉过表达Gq小鼠 失代偿性离

11、心性肥大对照小鼠 代偿性向心性肥大导入无活性Gq 抑制心肌肥大注射Gq抗体 消除ANP表达(3) RGS转基因小鼠（ RGS Transgenic Mice ）G蛋白信号调节蛋白(regulator of G protein signalling, RGS) 心脏表达：RGS3/4作用：激活GTP酶，使Gq的信号 转导减弱RGS GqGTP酶活性 对照动物 左室肥厚和 ANF表达 RGS4转基因小鼠 减轻 RGS4增强Gq失活，减轻心肌肥大结扎主动脉（ -adrenoceptor Kinase or GPCR Kinase 5 Transgenic Mice ）2. -肾上腺素受体激酶或G蛋白

12、偶联受体激酶5转基因小鼠过表达-ARK或GPCRK 5心 力 衰 竭-AR 脱 偶 联（ IGF-1 or NGF Transgenic Mice）3. IGF-1或NGF转基因小鼠过表达生长因子心肌细胞过度肥大心 力 衰 竭扩张性心肌病（ Isolated/Cultured Cardiac Myocyte）三、分离培养的心肌细胞 在活细胞或分子水平研究心力衰竭发生、发展规律以及药物作用等。ApplicationsAdvantages无神经体液因素及肝肾解毒功能的影响无心肌组织中心肌细胞渗透延缓问题,尤其适用于细胞内外离子转运研究可排除血管因素在整体心肌组织解剖上的差异消除细胞间隙的影响及细胞

13、之间机械牵拉所造成的对细胞质膜的破坏（一）新生大鼠心肌细胞（ Neonatal Rat Cardiomyocyte ） 细胞纯度高 刺激可控制AdvantagesIdentification of cell types in cultured cells. To characterize cell types in the culture, immunocytochemical staining was performed with anti-sarcomeric -actin antibody（400）.分化不完全肥大的诱导时间过短刺激过分单纯为人工系统，必须严格控制实验条件Limitati

14、ons（二）成年大鼠心肌细胞（ Adult Rat Cardiomyocyte ）细胞已分化Advantages分离培养的费用高细胞成活的时间短Limitations四、干细胞与心肌梗死的治疗(Stem Cell & Treatment of Myocardial Infarction)内科药物治疗 心脏血运的重建心脏移植术 干细胞移植Treatment of MII. Definition of Stem Cell 具有高度自我更新能力并有多向分化潜能的细胞，称为干细胞。 II. Classification of Stem Cell胚胎干细胞 Embryonal Stem Cell躯体全能

15、干细胞 Somatic Totipotent Stem Cell组织库躯体祖细胞（组织干细胞） Somatic Progenitor Cell of Tissue Reservoir胚胎干细胞（Embryonal stem cell, ESC）来源：胚泡内细胞群或原生殖细胞特点：1.能在体外不断生长增殖 2.子代细胞有相同的基因型和表现型 3.具有多向分化潜能，可分化为各种 组织和器官骨髓干细胞（Bone Marrow Stem cell, BMSC）来源：骨髓分类：造血干细胞、间充质干细胞特点：多向分化潜能与ESCs相似组织干细胞（Tissue Stem cell, TSC）来源：各种组织特

16、点：可塑性有限（limited plasticity）常用：成纤维细胞、成肌细胞胚胎干细胞由于政治、伦理甚至宗教原因，远不能用于临床。目前，只有自体同源的骨髓干细胞和骨骼肌成肌细胞可能用于心肌梗死后的心肌重建。（三）干细胞与心肌梗死1.骨髓干细胞移植（BMSC Transplantation）骨髓干细胞平滑肌细胞心肌细胞内皮细胞Preclinical Study单核骨髓干细胞平滑肌细胞心肌细胞内皮细胞穿越Coronary capillary内皮分布于受损的心肌组织中Preclinical Study经皮冠脉内注射同源单核BMSC冠脉旁路移植术+同源BMSC心肌内注射Phase I Clinic

17、al TrialBMSC TransplantationImproved Contractile Performance of Infarcted MyocardiumMyogenesisMyocytesAngiogenesisNew vesselsOperation Timing 心肌梗死后23天到数周过早：BMSC分化为炎症细胞过晚：BMSC在陈旧的梗死瘢痕中失去分化能力 无副作用，尤其是无明显的致心律失常效应。Advantages2.骨骼肌成肌细胞移植（Skeletal Myoblast Transplantation）移植后存活率足够高移植后可分化为心肌细胞样细胞心肌细胞样细胞可嫁接于

18、梗死的心肌组织Preclinical StudyABNon-stained photographs of preparations from in vitro cell culture (magnification 200). Myoblasts used for transplantation(A) and preparation confirming the cultured myoblasts capability of transformation into myocytes in vitro in serum-free conditions(B). 在多种动物（大鼠、家兔、狗、猪、绵羊） 经多种手段检测发现：移植后心肌舒缩功 能改善。Preclinical StudyPhase I Clinical Trial经皮冠脉内注射同源成肌细胞冠脉旁路移植术+同源成肌细胞心肌内注射 骨骼肌成肌细胞高度耐缺氧，即使移植到陈旧性梗死瘢痕中仍可分化为心肌细胞样细胞。Advantages 移植到陈旧性梗死瘢痕中有时会引起室性心律失常，可预防性使用胺碘酮。Limitations美国印第安纳大学医学院Field等和斯坦福大学医学院Balsam等日前的2项研究结果使当前的研究热点 “骨髓干细胞可修复心肌”理论遭受质疑。他们发现，注入