分子生物学技术在中药作用机理研究中的应用

1、分子生物学技术在中药作用机理研究中的应用 作者：范秀娟， 郭姣，杨国柱 ，罗朵生【摘要】 在文献检索的基础上，对近10年来在中药作用机理中主要应用的分子生物学技术核酸分子杂交技术、反转录-聚合酶链式反应技术、差异显示PCR技术和DNA阵列技术的基本原理、应用实例、优势与不足做了概述，并对未来的中药机理研究技术、方向和前景做了展望。 【关键词】 分子生物学技术；中药；作用机理中药自古以来就是我国人民防治疾病的主要武器，对中华民族的生存与繁衍起着不可忽视的作用，长期的医疗实践累积了宝贵而丰富的经验，并与中医学共同形成了一套完整独特的理论体系。但如何用现代科学技术语言阐释其作用机理，提供科学依据，使

2、其广为世界接受是一重大难题。近年来，分子生物学技术的发展，不仅根本性地改变了生命科学的研究方式，也为中药的作用机理研究提供了有力工具和良好的发展契机，使得中药基因转录水平的机理研究成为可能。笔者对近10年来有关分子生物学技术在中药基因转录水平作用机理研究中的应用综述如下。 1 核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术是分子生物学的基本技术之一，基本原理是具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下按碱基互补原则退火形成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针。其中将核酸提取分离后在体外与探针杂交的是印迹杂交，直接在组织细胞内进行的是原位杂交。 中药作用机理研究中较早常用的有RNA印迹杂交(Northern

3、 blot),点杂交（dot blot）和原位杂交。二仙汤是治疗妇女更年期综合征、抗衰老的名方，具温补肾阳、泻相火、调冲任功能。廖柏松等1采用Northern blot对18月龄雌性大鼠下丘脑内阿片肽的基因表达水平进行研究，结果表明，二仙汤组内啡肽前体阿黑皮素原和脑啡肽原的mRNA水平明显升高，达到未衰老前水平。沈小珩等2则从衰老过程抗氧化酶活性降低，且酶活性降低与其蛋白质基因表达水平降低平行的现象出发，采用分子杂交等技术考察二仙汤及其拆方对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶基因表达水平及其活性的影响。结果表明，抗氧化酶活性显著升高，且与其mRNA表达水平升高呈平行关系,提示二仙汤抗衰老是通过增强抗氧

4、化酶基因表达水平而实现的。海风藤有祛风除湿、通经活络的功效。韩恩吉等3采用Northern blot观察它对人类神经母细胞瘤细胞系列淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein ,APP) 基因表达的抑制作用。结果发现，海风藤选择性地抑制APP基因表达,为其防治阿尔茨海默病提供了一定依据。郑钦岳等4应用dot blot研究了补血和血方四物汤对白细胞介素6（interleukin6，IL6）mRNA表达的影响，实验表明,四物汤在0.011.00ng/m 浓度内可使IL6 mRNA的表达明显增加。保心丸具有降脂、降低血浆内皮素、抑制血小板聚集等作用。 为进一步阐明保心丸抗实验

5、性动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）的机理, 樊永平等5用原位杂交技术研究内皮素（endothelin，ET）和一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS) 在AS家兔主动脉壁的基因表达。 结果证实，保心丸组ET1mRNA 的表达较模型组低, 而NOS mRNA 较模型组高, 提示保心丸调节血管内源性NO和ET之间的平衡可能是其抗实验性AS的机理之一。精制血府胶囊是血府逐瘀汤的化裁精简方，其抗心肌缺血疗效明显优于原方，为揭示其作用机制，证实其疗效，王伟等6，7分别采用Northern blot和原位杂交等技术，研究其对于心肌缺血密切相关基因表达的影响

6、，前者结果表明精制血府胶囊显著提高缺血缺糖心肌细胞NOS mRNA表达水平，后者的精制血府胶囊组，ET1和内皮素转换酶（endothelinconverting enzyme，ECE）1的mRNA表达较其它组明显减少，且心肌细胞损伤也较其它组显著减轻。因而推测精制血府胶囊可能是通过提高NOS表达、促进NO生成及抑制ET1、ECE1的基因表达，减少ET1生成，减轻其对心肌细胞的直接损伤，发挥保护心肌细胞的作用。 Northern blot 是用来测量真核生物RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法，并可从大量RNA样本中同时获得这些信息，但需要大量的材料，受RNA降解影响大，敏感性低。dot bl

7、ot的不足之处在于点于同一张膜上同样的样品杂交信号有时不稳定，且一般要用纯化的RNA样品。原位杂交的优势在于可对组织细胞中的核酸进行精确定位。核酸分子杂交是分子生物学基本技术，随着反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）技术、差异显示PCR （differential displayPCR ，DDPCR）、DNA阵列等优势技术的出现、逐渐成熟而应用渐增，近5年应用基本的分子杂交技术研究中药作用机理的报道已少见。 2 RTPCR技术PCR是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或

8、DNA序列的方法，RTPCR是从RNA扩增cDNA拷贝的方法，即先将RNA反转录成cDNA，再用PCR扩增，使其敏感性大大提高，解决了dot blot或Northern blot中目的mRNA含量太低的问题，是目前中药机理研究中最常用的分子生物学技术，从发表的文献数量可以反映出来。 这方面的研究报道包括有Gumiganghwaltang (GMGHT)抗炎机制的研究， KIM S J 等8研究其在小鼠腹膜巨噬细胞中的抗炎机制，结果显示，GMGHT以剂量依赖的方式降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha

9、 ，TNF）,IL6和环氧酶2 mRNA表达水平，推测这是GMGHT减少炎症的重要分子机制之一。为了阐释二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理，郑小伟等9考察了二仙汤不同时间对肾阳虚大鼠垂体促肾上腺皮质激素(adrenocortico trophic hormone，ACTH) 基因表达的影响。结果是二仙汤可以上调垂体组织ACTH基因表达，且表达量随用药时间延长而增加，提示上调ACTH mRNA表达是二仙汤治疗肾阳虚证的作用机理之一。地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血病，补肾生血方具有补肾、益髓、生血作用，用于治疗杂合子患者疗效明显。为揭示其分子机理，吴志奎等10采用RTPCR等技术考察了用药者的、和珠蛋

10、白mRNA转录水平。结果发现，补肾生血胶囊能明显提高地中海贫血患者血红蛋白（hemoglobin，Hb）和抗碱血红蛋白（hemoglobin F），Hb珠蛋白链比增加，珠蛋白mRNA转录水平相应升高，说明补肾生血药具有促进珠蛋白转录和表达，诱导HbF合成作用，代偿了珠蛋白基因的缺陷。益髓生血颗粒是补肾生血方的颗粒剂，易杰等11研究了其对地中海贫血患者造血刺激因子干细胞因子（Stem cell factor，SCF）及人红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，EPOR）mRNA表达的影响。结果显示，治疗后,外周血EPOR、SCFmRNA表达明显增强，因此推测益髓生血颗粒

11、可能是通过影响SCF以及EPOR mBNA表达来促进骨髓造血,提高Hb、红细胞的水平,达到治疗地中海贫血的目的。陈智松等12-14从此方的抗衰老及中医肾生髓理论的角度出发，分别研究其对骨髓有核细胞中诱导细胞凋亡、促使机体衰老的原癌基因cmyc、抑制细胞凋亡的原癌基因Bcl2和造血刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimutaing factor，GMCSF)基因表达的影响。结果表明，衰老时高表达的骨髓cmyc，明显降低的Bcl2 和GMCSF，用药后，前者表达水平明显下降甚至不表达，后两者表达明显提高。因此认为补肾生血方通过抑制cm

12、yc的表达，促进Bcl2表达，从而抑制骨髓细胞凋亡，延长细胞寿命，延缓了衰老，并结合有关的医学成果，认为Bcl2 和GMCSF是肾生髓的本质相关基因。凌云彪等15研究清热活血补益方(肝纤方)对大鼠肝脏型前胶原mRNA 的表达和胶原酶活性的影响。结果表明,以清热活血补益方制备的含药血清抑制了型前胶原mRNA 的表达，胶原酶的活性增加。提示此方抑制型前胶原mRNA 的表达,减少胶原的合成,同时提高胶原酶的活性促进胶原的降解,可能是其抗肝纤维化的部分机制。此外，蔡晶等16通过检测雌激素受体(estrogen receptor，ER)和mRNA 表达量，考察了补肾阳中药淫羊藿和补肾阴中药女贞子对雄性大

13、鼠杏仁核和皮质顶叶ER mRNA的调节表达差异,结果显示，两用药组大鼠杏仁核、皮质顶叶ERmRNA表达量无明显变化, ERmRNA 表达量都上调，且淫羊藿组高于女贞子组，说明补肾中药可能是通过对ER的调节来发挥作用。 RTPCR的独特优势在于RNA纯度不必很高，仅少量RNA模板即能满足实验所需，尽管实践中RTPCR还远达不到理论上能检测到单一拷贝的RNA样品的敏感度，但远高于Northern blot。尤其适用于可获得的mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时测定基因表达的强度。只是扩增步骤中样品间扩增效率的微小差异将极大地影响信号强度，使用内参照可以减少这一问题，但无法彻底排除17。总的来说

14、，RTPCR是测量RNA样品中低丰度mRNA时的最佳方法。 3 DDPCR技术 1992年，梁鹏等建立了一种对不同来源的mRNA样品用PCR技术对其中许多的cDNA基因一起进行扩增和显示的实验方法，即DDPCR。该方法依赖2套不同类型的合成寡核苷酸引物：一套锚定反义引物与一套随机正义引物。最后通过比较不同来源的扩增cDNA产物的电泳带谱，能够发现差异表达的基因。 中药作用机理研究中应用DDPCR的报道有唐发清等18对有抗鼻咽癌作用的益气解毒片干预鼻咽癌细胞基因表达的研究，旨在从基因选择性表达水平探讨其抗鼻咽癌的机理。结果表明, 益气解毒片在体外能抑制鼻咽癌细胞基因的表达, 同时诱导一些特异基因

15、的表达, 从而抑制鼻咽癌细胞的增殖。 相比以往的方法，DDPCR技术提供了几方面理论上的优势，如理论上能够灵敏地检测组织或细胞中表达量极低的mRNA样品的差异表达，能鉴别特定组织或细胞来源样品之间转录水平的mRNA定性和定量变化。这种优势同样可体现在中药机理研究中，可同时显示中药作用后对多种基因转录的不同影响，将有影响的靶基因条带回收，再扩增、克隆、测序，查询确定是什么基因，是已知或未知序列，这样就可以确定中药起效可能源于影响那些基因转录。但这些优势目前部分还停留在理论上，还有许多技术问题有待解决，如经DDPCR鉴定出来的超过半数的cDNA是假阳性条带，靶细胞的总mRNA中的一部分不能被高水平

16、扩增、造成丢失等17。尽管目前DDPCR应用在中药基因转录水平的机理研究报道还很少，但毋庸置疑，其潜力巨大。 4 DNA阵列技术 DNA阵列技术是新发展起来的可同时分析数千个基因表达谱的技术。其原理同核酸分子杂交。在不同的文献中的称谓不尽相同，如基因芯片、DNA芯片、微阵列等，目前没有明确区分，通常混用。 目前有零散的采用商用或自制微阵列研究中药基因表达水平的报道。如周联等19采用含2 048个基因的小鼠基因表达谱芯片检测黄连解毒汤及其成分黄芩苷和盐酸小檗碱对LPS造型的小鼠脾细胞基因表达的影响，结果复方的作用明显优于有效成分的作用，但对具体基因表达影响的分析存在一定难度。王广良等20用自制的

17、包含24个细胞周期相关基因的cDNA微阵列，对抑制肝癌细胞增殖的4种中药乌药、青蒿、紫草和黄芪的抗肿瘤分子机制研究表明，4种中药对细胞周期基因和损伤检测点基因均有不同程度改变,表现为部分上调,部分下调,通过分子生物学技术进一步验证了用其治疗癌症的合理性。 在中药作用机理研究中，DNA阵列技术可以同时对使用中药前后的数千个基因表达情况进行比较和差异分析；且具有所需样品的用量极少、自动化程度高、被测目标DNA密度高的优点。但目前微阵列技术也存在许多问题，如其小型化和高通量的特点使得对外界和内部的变动都很敏感，因此宜采用取平均值并标准化操作的办法，但目前尚无普遍认可的规则和标准来指导微阵列实验，数据

18、采集和分析方法及操作系统也存在很大不同17。此外，基因表达与调控研究的滞后，使得中药机理研究中获得的很多信息难于解释；昂贵的制作费用也是一个限制因素。 5 展望 总体来讲，中药的作用机理研究应是多水平的，不仅包括基因转录水平，也包括转录后、蛋白质翻译及翻译后水平的调控上，对每个特定的中药/中药复方，可能不一定在各水平上都有影响，基因转录水平的机理研究主要就是考察对相关靶基因mRNA水平的改变，也是目前分子生物学技术在中药机理研究中的主要应用范畴。中药尤其是中药复方的多成分多功效决定了其很可能对基因转录水平有影响，已完成的研究结果已证明了这一点。 中药的机理研究通过应用分子生物学技术已深入到几乎

19、是最根本的基因转录水平，并在该水平上对中药的疗效获得了一定解释，但整体上还处于探索阶段。已有的研究主要是应用如核酸分子杂交、RTPCR技术等考察“单基因”的技术，应用如DDPCR、DNA阵列等研究多基因的技术的报道较少。中药调节机体平衡的特点决定了对基因转录的影响很可能是对多基因的协同影响，如对补肾生血方的系列研究已表明此方的功效与影响EPOR、SCF、cmyc、Bcl2、GMCSF基因表达有关。因此，应用研究多基因表达的技术考察对多基因的协同影响将是未来中药基因转录水平作用机理研究的主要方向。相信随着现有技术的不断发展和完善、新技术的出现及多种技术相结合加上疾病细胞分子水平研究的深入，复杂的

20、中药作用机理会逐步得到阐释，中药的疗效和可能发现的新功效将从机理上获得科学依据，为中药获得像西药一样的市场准入权提供有力的支撑。【参考文献】 1 廖柏松，胡燕，鞠躬，等.二仙汤对18月龄雌性大鼠下丘脑EOP含量及其mRNA水平作用的实验研究J.山东中医学院学报，1996，20（6）：399-401.2 沈小珩，方肇勤，吴敦序，等.二仙汤及其拆方对老年大鼠部分抗氧化酶活性及其基因表达水平的影响J.中国中西医结合杂志，l995，15（1l）：672-674.3 韩恩吉，RAJIV J.海风藤抑制淀粉样前体蛋白基因表达的研究J.中国中药杂志,1998, 23(11): 691-694.4 郑钦岳，曹

21、尉尉，曹颖瑛，等.四物汤增加小鼠脾细胞分泌IL6及促进IL6 mRNA 的表达J.第二军医大学学报,1998,19 (3):290-292.5 樊永平,王绵之,王伟,等.保心丸抗实验性动脉粥样硬化的机理探讨J.北京中医药大学学报,1997, 20(1):33-34.6 王伟，陈可冀，史大卓，等.精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞一氧化氮合酶基因表达的影响J.中国中西医结合杂志，1996，16（11）:670-672.7 王伟，史大卓，陈可冀，等.精制血府胶囊对缺氧缺糖心肌细胞ET1与ECE1基因表达影响的研究J.中国医药学报,2000,15(4):17-20.8 KIM S J, JEONG H J, MOON P D,et al.Anti-inflammatory activity of gumiganghwaltang through the inhibition of nuclear factorB activation in peritoneal macrophagesJ.Biol Pharm Bull, 2005,28(2): 233-237.9 郑小伟，包素珍，李荣群，等.二仙汤对肾阳虚大鼠垂体ACTH 基因表达的影响J.中国医药学报,2003,18(12):716-719.10 吴志奎，蔡辉国，陈佩贞，等.补肾生血方对-地中海贫血基因水平的