参考在临床病理中的应用

1、免疫组化在临床病理中的应用肿瘤医院病理科 陆洪芬免疫组化原理用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测免疫组织化学方法分类按照标记物的种类分为： 免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等 病理诊断中常用免疫组化方法EnVision两步法目前最常用ABC法（抗生物素生物素过氧化物酶复合技术）LAB法（标记生物素抗生物素技术）抗体的基本结构重链Fab轻链Fc四条多肽链，呈Y型轻链两条Fab,结合抗原重链两条Fc，结合二抗重链决定抗体的类型IgA,IgD,IgE,IgG,IgMCOOHEnVision两步法原理 肿瘤细胞抗原二抗一抗HRP酶

2、polymer免疫组化检测组织或细胞标本组织标本 石蜡切片，冰冻切片 石蜡切片免疫组化中首选的组织标本制作方法，但对组织内 抗原暴露有一定的影响，可进行抗原修复。细胞标本 组织印片、细胞爬片和细胞涂片 EnVision两步法 步骤将45m 的石蜡组织切片进行常规脱蜡脱水置0.01M pH6.0 柠檬酸中，100修复抗原10分钟，保温10分钟 滴加一抗（根据产品说明书做相应稀释）于切片上，反应过夜 TBS洗涤3次，2分钟/次 滴加二抗于切片上，37反应1小时 TBS洗涤3次，2分钟/次 DAB显色1545分钟 待组织呈棕色时终止显色，水洗干净 苏木复染 脱水、透明、封片常用缓冲液的配制0.5M

3、TBS pH7.6 Tris 60克,NaCl 85克,HCl 34毫升,溶于1000毫升蒸馏水，用时稀释10倍。0.1M柠檬酸 pH6.0 柠檬酸21g, 2N, NaOH调pH至6.0，蒸馏水加至1000ml,用时稀释10倍。柠檬酸三钠缓冲液 pH6.0 58.5g柠檬酸三钠，浓HCL调pH至6.0，蒸馏水加至1000ml,用时稀释20倍（如：25ml母液用475ml蒸馏水稀释至500ml工作液）。EDTA缓冲液 PH8.0 0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。DA

4、B显色液 3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochloride Dihydrat（DAB）40 mg，TBS 缓冲液100ml，H2O2 40l。抗原修复抗原修复液 0.1M柠檬酸 pH6.00.5M或1.0M EDTA缓冲液 PH8.0抗原修复方法 热修复微波，水浴，高压 蛋白酶消化胰蛋白酶最常用抗原修复时注意： 热抗原修复后应注意自然冷却 热处理过程中修复液切勿煮干一 抗 类 型单克隆抗体 B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备多克隆抗体 将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物 一抗孵

5、育一抗稀释度 根据抗体说明书的稀释范围找出最佳稀释度一抗孵育时间、温度 4 冰箱 过 夜 37温箱 /常温 2小时 免疫组化的自动化 BenchMarkXT （ ROCHE公司）Bond-Max ( LEICA公司)免疫组化结果的判断阳性判断阳 性 定 位 细胞核 细胞浆 细胞膜免疫组化分数 染色强度阳性细胞数 染 色 强 度 弱阳性 中度阳性 强阳性 阳性细胞数 110 1150 5080 80%设立对照阳性对照阴性对照自身对照免疫组化结果的判断阴性细胞核ERPRHER2/neu 细胞膜CD117细胞浆假阴性结果抗原修复方法欠佳抗体失活或浓度不当抗原丢失或减弱技术失误假阳性结果抗体的交叉反应

6、组织中抗体的非特异性结合内源性酶的着色肿瘤组织中残余正常组织组织中抗原的弥散“异位”抗原的表达免疫组化的优点高度特异性敏感性高方法步骤统一形态、机能和代谢密切结合免疫组化在病理诊断中的应用提高病理诊断准确性 肿瘤来源、性质的判断对预后的判断 对肿瘤增生程度的评价发现微小转移灶指导肿瘤治疗 如 ER PR Neu CD117 EGFR VEGF提高病理诊断准确性病理诊断准确率： 单纯常规HE切片 约8595； HE+免疫组织化学法 约9598； HE+免疫组织化学分子生物学 约99。确定肿瘤起源或分化表型 肿瘤来源的判断上皮来源 CK间叶来源 VIM淋巴造血系统 LCA恶性黑色素瘤 HMB45肿

7、瘤性质的判断 良恶性病变的鉴别，如：淋巴结反应性增生与滤泡性淋巴瘤肿瘤的分型判断 如：淋巴瘤分型 预后的判断提示预后好的指标 如：nm23 ER PR 提示预后差的指标 如：HER2/Neu p53 c-myc 对肿瘤增生程度的评价Ki67 在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关 PCNA （增殖细胞核抗原）EGFR（表皮生长因子受体） 发现微小转移灶乳腺癌的前哨淋巴结检查恶黑术中区域淋巴结的清扫等寻找感染病因 人乳头状瘤病毒（HPV）乙型肝炎病毒（HBV） 免疫组化对靶向治疗的指导意义CD20HER-2/neu蛋白c-kit和PDG

8、FRA蛋白HER-1/EGFR蛋白CD20的检测 正常B淋巴细胞从前B细胞直至分化到前浆细胞均表达CD20，而浆细胞通常不表达CD20，绝大多数B细胞淋巴瘤（BCL）表达CD20，一些浆母细胞和浆细胞分化的BCL和少数小BCL不表达CD20。 应用免疫组织化学方法可检测BCL是否表达CD20，阳性反应定位在细胞膜上。凡CD20+ BCL都可用Rituxan治疗。CD20雌孕激素的检测乳腺癌中ER、PR的检测 对内分泌治疗具有重要指导意义ERPR结果：-，+，+，+Ariol 3.2不只成像, 而且定量Ariol病理学工作站 (Applied Imaging公司) 高通量、自动化的图像扫描及分析

9、系统Ariol 系统在临床诊断中的应用三个功能模块通过美国FDA认证免疫组化分析(乳癌Her-2/neu、ER、PR表达分析）细胞和组织FISH分析(Her-2/neu基因扩增分析）骨髓中稀有细胞查找 Ariol系统对ER，PR的定量分析HER2/neu蛋白的检测 分化差的乳腺癌表达HER-2/neu。免疫组织化学方法可检测癌细胞是否过度表达HER2蛋白，阳性反应必须定位在细胞膜上，阳性强度必须+，才能用Herceptin靶向治疗。 如弱阳性或中度阳性（+），则必须用CISH、FISH或其它方法进一步检测。FISH：无扩增IHC： 2FISH：有扩增IHC： 3 c-kit蛋白和PDGFR的检测C-kit基因或PDGFR基因突变