《生物化学》本科课件第3章+氨基酸

1、(Amino Acid, AA, Aa, aa)第3章 氨基酸蛋白质的构件分子Protein Architecture一、氨基酸蛋白质是生物功能的主要载体，而氨基酸是蛋白质的构件分子。自然界存在的成千上万种蛋白质，在结构和功能上的惊人的多样性主要由氨基酸的内在性质造成的。（一） 蛋白质水解蛋白质和多肽的肽键可被催化水解1.酸水解 （H2SO4;HCl)优点：不引起消旋作用。缺点：色氨酸被破坏，部分羟基氨基酸被分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。2.碱水解（NaOH)优点：色氨酸是稳定的缺点：多数氨基酸遭到不同程度的破坏，并且产生消旋现象。完全水解得到各种AA的混合物蛋白质月示胨多肽肽A

2、A 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500完全水解得到各种AA的混合物羧肽酶和氨肽酶胰蛋白酶（trypsin）胃蛋白酶（pepsin）糜蛋白酶（chymotrypsin）嗜热菌蛋白酶3. 酶水解得到多肽片段和AA的混合物一般是部分水解，优点：不产生消旋，也不破坏氨基酸缺点：部分水解，需要多种酶协同作用才能使蛋白质完全水解；需时较长。常用蛋白酶（二） 氨基酸的结构地球上天然形成的AA180种以上。构成蛋白质的常见AA只有20余种（更确切地说为19种氨基酸和一种亚氨基酸即脯氨酸），且都是-氨基酸。 AA同时含有氨基和羧基， AA间可进行聚合反应形成肽键。什么是氨基酸

3、？-C-C-C-C-COOH -C-C-C-C(NH2)-COOH -氨基酸 -C-C-C(NH2)-C-COOH -氨基酸 -C-C(NH2)-C-C-COOH -氨基酸什么是-氨基酸？ 大多数AA在中性pH时呈兼性离子状态:除甘氨酸外，19种AA都具有旋光性。除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水。蛋白质中发现的氨基酸都是L型的。COO-NH3+二、氨基酸的分类生物体中发现的氨基酸180多种，大多数是不参加蛋白质组成，这些称为非蛋白质氨基酸。蛋白质组成的常见氨基酸或称基本氨基酸只有20种，称为蛋白质氨基酸。存在某些蛋白质的不常见氨基酸都是肽链上由常见氨基酸修饰转化而来。（一）常见的蛋白质氨

4、基酸中文名称英文名称三字母缩写单字母符号甘氨酸Glycine Gly G丙氨酸 AlanineAlaA缬氨酸ValineValV亮氨酸LeucineLeuL异亮氨酸 Isoleucine IleI脯氨酸ProlineProP苯丙氨酸 Phenylalanine PheF酪氨酸TyrosineTyrY色氨酸Tryptophan TrpW丝氨酸 Serine SerS苏氨酸 ThreonineThr T半胱氨酸 Cystine CysC蛋氨酸 MethionineMetM天冬酰胺Asparagine Asn N谷氨酰胺 Glutarnine GlnQ天冬氨酸 AsparticacidAspD谷氨酸

5、Glutamicacid Glu E赖氨酸LysineLysK精氨酸ArginineArgR组氨酸HistidineHisH中文名称英文名称三字母缩写单字母符号氨基酸的简写符号按R基的化学结构20种常见氨基酸可分为：脂肪族氨基酸（1）中性氨基酸（2）含羟基或硫氨基酸（3）酸性氨基酸及其酰胺（4）碱性氨基酸2.芳香族氨基酸3.杂环族氨基酸按R基的极性性质， 20种常见氨基酸可分为：非极性R基氨基酸不带电荷的极性R基氨基酸带正电荷的R基氨基酸带负电荷的R基氨基酸常见氨基酸分类按基的化学结构分类：、脂肪族aa（）中性aa 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸（2）含羟基或硫aa丝氨酸 半胱氨酸

6、苏氨酸 甲硫氨酸胱氨酸由两个半胱氨酸通过侧链上的-SH基氧化成共价的二硫键连接而成（）酸性aa及其酰胺天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺（）碱性aa 赖氨酸 精氨酸、芳香族aa苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸、杂环aa 组氨酸 脯氨酸按基的极性性质分类：、非极性基aa、不带电荷的极性基aa3、带正电荷的基aa4、带负电荷的基aa（二）不常见的蛋白质氨基酸 由常见aa经修饰而来。4-羟脯氨酸主要存在结缔组织的胶原蛋白5-羟赖氨酸主要存在结缔组织的胶原蛋白6-N-甲基赖氨酸 存在某些肌肉蛋白如肌球蛋白g-羧基谷氨酸主要存在凝血酶原和一些与血液凝固有关的蛋白质中甲状腺球蛋白中分离出（三）非蛋白质氨基酸 1

7、50多种多是蛋白质中L型-AA衍生物有一些是-，-，-AA有些甚至是D-型AA鸟氨酸瓜氨酸尿素循环的中间物三、氨基酸的酸碱性质（一）兼性离子过去常认为氨基酸在晶体甚至水溶液中是以不解离的中性分子存在，也就是一般的有机物。后来发现，AA晶体熔点很高，此外，AA能使水的介电常数增高。如何解释这个事实呢？如果AA在晶体或水中主要以兼性离子（偶极离子)形式存在，不带电荷的中性分子为数极少，就很好解释这个问题了。静电吸引 范德华力兼性离子形式的AA是强极性分子根据酸碱质子理论，酸是质子（H+）的供体，碱是质子的受体，因此酸和碱有同一性，在一定条件下，各自向相反方面转化。AA是一类两性电解质。AA完全质子

8、化时，可看成是多元酸侧链不解离中性AA可看作二元酸酸性和碱性AA可看作三元酸H3NCHCOOHR+H3NCHCOO-R+（pH=pI）H2NCHCOO-R（二）氨基酸的解离H+H+H+H+COO-H3N+水溶后等电荷状态总电荷 0加 酸H+ H+ H+COOH总电荷 “+”COO-H3N+水溶后等电荷状态加 碱总电荷 0OHOHOH H2NH2O总电荷 - HA A- + H+ K= H+*A-/HA pK= pH - lg A- / HA pH = pK + lg A- / HA 根据Handerson-Hasselbalch方程：K为解离常数氨基酸解离步骤：阳离子 (A+) 兼性离子 (A

9、0) 阴离子（A-） -Ka1+H+H+-Ka2+H+H+第一步解离，代表-COOH第二步解离，代表- NH3+第一步解离常数第二步解离常数共轭酸的解离常数按其酸性递降顺序编号为Ka1和Ka2甘氨酸滴定曲线氨基酸的解离常数可用测定滴定曲线的实验方法求得pKa2= pH - lg A- / A0(A0)(A-)(A+)pKa1= pH - lg A0 / A+滴定拐点就是兼性离子有一半变成阳离子或阴离子，也就是A- = A0或A0= A+，所以拐点处的pH值就是解离常数的对数值。氨基酸中的a-COOH基的酸性要比相应的脂肪酸强上百甚至几百倍，而a-氨基的碱性明显低于其相应的胺类。当氨基酸溶液在低

10、pH时，氨基以带正电荷的形式存在，带正电荷的氨基通过静电相互作用（诱导效应）使羧基更容易失去质子，成为更强的酸。而与之对应的是在羧基影响下，氨基更不容易捕获质子 侧链R基可解离的氨基酸解离及滴定 A+ A0A- -H+ -H+ Ka1Ka2A2- -H+ Ka3酸性氨基酸Ka1=A0 H+ / A+; Ka2=A- H+ / A0; Ka3=A2- H+ / A-; 谷氨酸的解离谷氨酸的滴定图中的pK1; pKR;pK2分别代表前面的pKa1; pKa2; pKa3 A+ A0A- -H+ -H+ Ka2Ka3 A2+ -H+ Ka1碱性氨基酸Ka1=A+ H+ / A2+; Ka2=A0 H

11、+ / A+; Ka3=A- H+ / A0; -H+ Ka1 -H+ Ka2 -H+ Ka3赖氨酸的解离组氨酸的滴定图中的pK1; pKR;pK2分别代表前面的pKa1; pKa2; pKa3（三）氨基酸的等电点当溶液为某一pH值时，AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一pH值即为AA的等电点（pI）。在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性AA等电点公式推导： A+ A0A- -H+ -H+ Ka1Ka2两公式相乘：Ka1Ka2=H+2A- / A+等电点时，A-=A+H+2= Ka1Ka2H+ =

12、(Ka1Ka2)1/2如以I代表等电点的H+I = (Ka1Ka2)1/2两边取对数pI =1/2 (pKa1+pKa2) 对于侧链含有可解离基团R的AApI取决于兼性离子（A0）两边pKa值的算术平均值。因为等电点时，氨基酸主要以兼性离子（A0）存在，A+和A-很小而且相等，A2-或A2+的量可以忽略不计。酸性AA：pI = (pKa1 + pKa2 )/2 碱性AA：pI = (pKa2 + pKa3 )/2 A+ A0A- -H+ -H+ Ka1Ka2A2- -H+ Ka3 A+ A0A- -H+ -H+ Ka2Ka3 A2+ -H+ Ka1四、氨基酸的化学反应主要指其-氨基和-羧基以及

13、侧链上的功能基团R参与的反应。（一）-氨基参加的反应1.与亚硝酸反应2.与酰化试剂反应3.烃基化反应4.形成Schiffs碱反应5.脱氨基反应 NH2 OH R CH COOH + HNO2 R CH COOH+H2O+N2Van Slyke 法测氨基氮（体积）的基础。N2中的1/2为氨基氮。 氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。 O COONa 在弱碱中 CH2 O C Cl + H2N CH （后酸化） R O COOH CH2 O C N CH +Na+Cl- H R苄氧酰氯苄氧酰氨基酸氨基酸氨基的保护措施，在多肽和蛋白质人工合成中作为氨基保护试剂丹磺酰氯末端aa标记和微量aa定量。NO2

14、FO2N+ H2NCHCOOHRNO2O2NHNCHCOOHR+ HF弱碱性DNP-氨基酸 （黄色）DNFBSanger 法测定N末端氨基酸基础N=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯PITC苯氨基硫甲酰衍生物苯乙内硫脲衍生物Edman降解法基础重复测定多肽链N端AA排列顺序，设计出“多肽顺序自动分析仪”原理：将肽与异硫氰酸苯酯(PITC试剂)在pH8-9下作用，肽的NH2末端接到异硫氰酸苯酯的C原子上生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC-肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽键断裂

15、形成乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH氨基酸) 和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又可出现一个新的N末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，乙内酰苯硫脲氨基酸是无色的，用有机溶剂抽提后，用高效液相层析法分离鉴定。这就是多肽顺序自动分析仪的工作原理。 R COOH R COO C=O + H2N CH C=N CH H R H R醛 氨基酸 Schiffs碱-H20+H20西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的中间物在生物体内经AA氧化酶催化即脱去-氨基而转变为酮酸。（二） -羧基参加的反应1.成盐或成酯反应2.成酰氯反应3.脱羧基反应4.叠氮反应（2）成酯 NH

16、2 干燥，HCl R CH COOH + C2H5OH 回流 R CH COOC2H5 + H2ONH3Cl保护羧基（1）与NaOH等形成盐 HN-保护基（如苄氧甲酰基） R CH-COOH + PCl5 HN-保护基 R CH-COOCl + POCl3 + HCl保护氨基 活化羧基常用于多肽人工合成成酰氯反应 NH2 脱羧酶 RCH-COOH R-CH2-NH2 +CO2酰化氨基酸甲酯酰化氨基酰叠氮 YNH O NH2NH2 RCHCOCH3 YNH O HNO2 RCHCNHNH2 YNH O RCHCN -N+ N + 2H2O 肼酰化氨基酰肼保护氨基 活化羧基，常用于多肽人工合成叠氮

17、反应Y:酰基（三）-羧基和-氨基都参加的反应1、 与茚三酮反应 2、 成肽反应弱酸 加热茚三酮反应 Pro和Hpro无游离氨基，只能形成 黄色化合物（440nm）； 可鉴定某化合物是否有可能是AA； 如果是AA可用 测压法 分光光度法 定量测定AA的含量 加热乙二醇二酮吡嗪（四） 侧链R基参加的反应1、Tyr（酪氨酸）2、碱性AA2、碱性AA3、带硫AATyr酚基在3和5位上易发生亲电取代反应，如碘化和硝化Tyr酚基还可和重氮化合物结合生成橘黄色的化合物用于检测TyrPauly反应His侧链咪唑基与重氮苯磺酸生成棕红色化合物Arg侧链胍基与环己二酮生成缩合物保护胍基，用于氨基酸序列分析以及结构

18、与功能研究Trp侧链吲哚基能被N-溴代琥珀酰亚胺氧化分光光度法测定蛋白质中Trp含量Met侧链上甲硫基：强亲核基团与烃化试剂成锍盐保护巯基此反应提供了胰蛋白酶水解位点，另外还保护-SH基不被重新氧化成二硫键。此反应能被巯基试剂逆转，逆转后，两甲基除去的机会相等，多用于14C的同位素标记。巯基能和各种金属离子（对氯汞苯甲酸）形成稳定程度不等的络合物，使酶失活。此反应也是蛋白质结晶学中制备重原子衍生物最常用的方法。与二硫硝基苯甲酸发生硫醇-二硫化物交换pH8.0时412nm最大光吸收分光光度法测定-SHCys的巯基不稳定，易被氧化成二硫键巯基在有痕量的金属离子如：Cu2+，Fe2+，Co2+或Mn

19、2+时，易被氧化Cys中的二硫键可被氧化剂（过甲酸）以及还原剂（巯基化合物）打开。磺基丙氨酸二硫苏糖醇五、AA的光学活性和光谱性质（一）AA的光学活性和立体化学a-氨基酸的a-碳是一个不对称原子（除了甘氨酸），因此具有旋光性。也分为两种构型D型和L型苏氨酸，异亮氨酸，羟脯氨酸和羟赖氨酸除了a-碳原子外，还有第二个不对称碳原子。因此有四种光学异构体。它们分别称为L-，D-，L-别-，D-别-氨基酸。L-苏氨酸D-苏氨酸L-别-苏氨酸D-别-苏氨酸胱氨酸（Cystine）的两个不对称中心是相同的，存在D和L两个异构体以及内消旋CystineL-cystineD-cystinemeso-cystin

20、e氨基酸的旋光性氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基性质，并且与测定的溶液pH有关，这是因为在不同的pH条件下氨基和羧基的解离状况不同。pH对L-亮氨酸（蓝）和L-组氨酸（红）的aD25值的影响比旋是a-氨基酸的物理常数之一，是鉴别氨基酸的一种根据（二）氨基酸的光谱性质可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（200400nm）：芳香族氨基酸Tyr/Trp/Phe 才有吸收 原因：含有苯环共轭p键系统-C=C-C=C-C=C-C=C-1、紫外吸收光谱Trp 280nmTyr 275nmPhe 257nm蛋白质含量测定蛋白质最大吸收在280nm分光光度法定量原理e:摩尔吸收系数，c:浓度；

21、l:吸收杯的内径或光程厚度；I0：入射光强度；I：透射光强度、核磁共振波谱核磁共振应用最初,核磁共振技术主要用于核物理研究方面,用它测量各种原子核的磁矩,误差仅是0. 003 %0. 005 %; 迄今,它已广泛应用于化学、食品、医学、生物学、遗传学等学科领域,已成为在这些领域开展研究工作的有力工具,甚至是某些领域(如:化学、医学诊断、药物学等) 常规分析中不可缺少的手段。1985 年,维特里希等人公布了第一次利用NMR 法测定的溶液中蛋白质蛋白酶抑制剂IIA ( proteinase inhibitor IIA) 的结构(如图 所示) 。1990 年用NMR 测定的蛋白质结构有23 个,而到

22、1994 年一年测定的蛋白质结构数上升到100个。六、氨基酸混合物的分析分离 利用AA成分分配系数的差异（一）分配层析法的一般原理 层析/色谱（chromatography）分配系数（Kd）：当溶质在两种互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值。Kd=cAcBKeff=cA VAcB VB有效分配系数（Keff）； VA， VB分别代表A相和B相的体积。溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变。逆流分溶的分离规律：分配系数大的物质移动越快转移次数越多（即分溶管越多），分溶曲线的峰形越窄而高。层析系统固定相流动相附着在固相上的液体固体 按两相所处状态分：流动相

23、液体气体固定相液体液液层析气液层析固体液固层析气固层析柱层析固定相装于柱内纸层析固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开薄层将有适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜与纸层析相似，纸用其它高分子有机吸附剂代替 按操作形式分：吸附固体 吸附能力不同分配液体 分配系数不同离子交换离子交换剂 亲和性不同凝胶多孔凝胶， 通过速度不同亲和固定相只能与一种组分结合，分开其它无亲和力的组分 按层析原理分： 固定相 各组分对固定相（二）分配柱层析 填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、淀粉、硅胶等，支持剂吸附着一层不会流动的水，可以看着为固定相，沿固定相流过的是与它互不相溶的溶剂（苯酚，正丁醇）收集的组分

24、用茚三酮显色定量。得出洗脱曲线。（三）纸层析（四）薄层层析（五）离子交换层析（六）气液层析层析系统的流动相为气体，如氢、氦、氮，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体，此层析技术为气液层析氨基酸由于含有各种极性基团，气化十分困难，必须转化为易挥发化合物才能进行层析PTH-氨基酸，然后经三甲基硅烷基化，便可得到很好气化的氨基酸衍生物。原理：（七）高效液相层析HPLC的特点：使用的固定相支持剂颗粒很细，表面积大溶剂系统采用高压，因此洗脱速度增大多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析，离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。思考题1. 构成蛋白质的氨基酸属于下列哪种氨基酸?( ) A. L-氨基酸

25、 B. L-氨基酸 C. D- -氨基酸 D. D- 氨基酸 2. 含有2个羧基的氨基酸是( ) A.谷氨酸 B. 苏氨酸 C.丙氨酸 D. 甘氨酸3.天然蛋白质中不存在的氨基酸是( ) A. 半胱氨酸 B. 瓜氨酸 C. 蛋氨酸 D. 羟脯氨酸1. A; 2. A; 3. B4. 280nm处有吸收峰的氨基酸( ) A. 精氨酸 B. 色氨酸 C. 丝氨酸 D. 谷氨酸4. B1.下列有关氨基酸的叙述，哪个是错误的? A.酪氨酸和苯丙氨酸都含有苯环 B.酪氨酸和丝氨酸都含羟基 C.亮氨酸和缬氨酸都是分支氨基酸 D.脯氨酸和酪氨酸都是非极性氨基酸 E.组氨酸、色氨酸和脯氨酸都是杂环氨基酸2.下

26、列哪一类氨基酸完全是非必需氨基酸? A.碱性氨基酸 B.含硫氨基酸 C.分支氨基酸 D.芳香族氨基酸 E.以上四种答案都不对 1. D; 2.E.下列氨基酸中哪些具有分支的碳氢侧链? (1).缬氨酸 (2).组氨酸 (3).异亮氨酸 (4).色氨酸 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,43. B二、是非题1 自然界的多肽物质均由L构型的氨基酸组成，完全没有例外2 组氨酸是人体的一种半必需氨基酸3 蛋白质中的所有的氨基酸（除甘氨酸外）都是左旋的4 脯氨酸与茚三酮反应生成紫色产物5 蛋白质中所有的组成氨基酸都可以用酸水解后用氨基酸分析定量测出 6 所有的氨基酸中，因碳原子是一个不对称原