分菌方法2(共7页)

1、一般液体(yt)或固体样品的细菌筛选(shixun)方案(fng n)：以无菌操作吸取样品lmL/1g于9mL无菌生理盐水中,呈1:10的稀释液，摇荡搅拌溶解，得到为10-1，依次类推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ；加适量稀释样品到45-55oC的MRS琼脂培养基/LB加富营养琼脂（加放线菌酮）；浇注平板37培养12-48h；用接种针从固体平板上沾取每个单菌落，将针点在已画好格的MRS琼脂培养基上，37培养12-48h，每个9CM平板点样20-30个为佳；观察记录和拍照平板上菌落形态，计数分类，镜检；挑选单菌落到相应的3ml液体MRS培养基中，37oC培养过夜（12h）；取

2、1mL实验所得菌液，加入1mL 60%灭菌甘油，装入保种管中，-80冰箱中保存。用另外大约1ml进行提取DNA，通过16s(bacteria) rDNA测序进行物种鉴定。酵母菌筛选流程:以无菌操作吸取样品lmL/1g于9mL无菌生理盐水中,呈1:10的稀释液，摇荡搅拌溶解，得到为10-1，依次类推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ，然后分别涂布到孟加拉红的含氯霉素PDA基，28培养12-48h。加适量稀释样品到45-55oC的PDA琼脂培养基；浇注平板28培养12-48h；用接种针从固体平板上沾取每个单菌落，将针点在已画好格的PDA琼脂培养基上，28培养12-48h，每个9CM

3、平板点样20-30个为佳；观察记录和拍照平板上菌落形态，计数分类，镜检；挑选单菌落到相应的3ml液体PDA培养基中，28oC培养过夜（12h）；取1mL实验所得菌液，加入1mL 60%灭菌甘油，装入保种管中，-80冰箱中保存。用另外(ln wi)大约(dyu)1ml进行提取DNA，通过26S（yeast）rDNA D1/D2 区PCR扩增测序进行(jnxng)物种鉴定。醋酸菌筛选流程：以无菌操作吸取样品lmL/1g于9mL无菌生理盐水中,呈1:10的稀释液，摇荡搅拌溶解，得到为10-1，依次类推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ，然后分别涂布到分离培养基上，30培养12-48h

4、。观察记录和拍照记录平板上菌落形态，并计数分类；用接种针从固体平板上挑选不同的形态的单菌落在分离琼脂培养基上进行划线纯化，重复一次或几次；挑选单菌落到相应的3ml液体分离培养基中，30oC培养过夜（12h）；取1mL实验所得菌液，加入1mL 60%灭菌甘油，装入保种管中，-70冰箱中保存。用另外大约1ml进行提取DNA，通过16s(bacteria) rDNA测序进行物种鉴定。谷氨酸菌筛选流程：以无菌操作吸取样品lmL/1g于9mL无菌生理盐水中,呈1:10的稀释液，摇荡搅拌溶解，得到为10-1，依次类推，依次得到10-2,10-3,10-4,10-5 ，然后分别涂布到分离培养基上，30-37

5、培养12-48h。观察记录和拍照记录平板上菌落形态，并计数分类；用接种针从固体平板上挑选不同的形态的单菌落在分离琼脂培养基上进行划线纯化，重复一次或几次；挑选单菌落到相应的3ml液体分离培养基中，30-37 oC培养过夜（12h）；取1mL实验所得菌液，加入1mL 60%灭菌甘油，装入保种管中，-70冰箱中保存。用另外(ln wi)大约1ml进行提取DNA，通过16s(bacteria) rDNA测序进行物种鉴定。准备(zhnbi)工作：灭菌：刀子、镊子、PDA固体基、生理盐水(shnglynshu)、空试管、空培养皿、锥形瓶（用于溶解酒饼）、PDA液体培养基、锥形瓶（用于液体培养）PDA培养

6、基（用于霉菌或酵母菌培养）和试管斜面：马铃薯（去皮）：200g；蔗糖（或葡萄糖）：20g（霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖）；水1000ml；自然PH；煮烂（煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可），八层纱布过滤，按照培养基体积加入1.5-2%量的琼脂，加热，直接 121灭菌20分钟左右倒平板，或加热后试管中加入3-4mL到试管中，然后再灭菌，结束后等高压锅自然降压后，取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。YPD培养基（用于霉菌或酵母菌培养）：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g、琼脂20g、水1000ml；将葡萄糖溶解在水中，添加蛋白胨及酵母膏，混匀后，加琼脂溶化，灭菌。醋酸菌分离培养基（用于醋酸菌

7、培养）葡萄糖 1%，酵母膏1%，无水乙醇3%，0.04%的溴甲酚紫5%，琼脂1.8%，水100mL，0.1MPa灭菌20分钟。乙醇在灭菌后培养基温度降到75度左右加入。谷氨酸菌分离培养基（用于谷氨酸菌培养）葡萄糖 2%，玉米浆0.2%，磷酸(ln sun)氢二钾0.1%，硫酸镁0.04%，尿素0.2%，溴麝香草酚兰（BTB）0.01%，琼脂2%，Mn2+、Fe2+各2ppm,PH 6.7,尿素(nio s)与BTB分别灭菌。MRS培养基（乳酸菌筛选(shixun)培养基）：配制（1L）:蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母提取物 5.0g，K2HPO4 2.0g，柠檬酸三铵 2.0g，

8、乙酸钠 5.0g，葡萄糖 20.0g，吐温80 1.0mL，MgSO47H2O 0.5g，MnSO44H2O 0.25g；调PH至6.26.4；酪蛋白胨 10g/L，牛肉浸膏 8g/L,酵母浸膏 4g/L，磷酸氢二钾 2g/L，柠檬酸二铵2g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1g/L，葡萄糖 20g/L，醋酸钠 5g/L，硫酸镁 0.2g/L，硫酸锰 0.04g/L，琼脂 14g/L。CaCO3溶圈法：2.称取20g CaCO3加入到100mL蒸馏水中，制成CaCO3乳浊液；3.将MRS培养基和CaCO3乳浊液分开灭菌；4.倒平板前，待培养基融化冷却后，平板上加入一定量的CaCO3乳浊液，晾干

9、了以后再接种。 溴甲酚绿指示剂法：1、培养基：MRS培养基（含溴甲酚绿酒精溶液）2、同上，不同之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。DNA分离及PCR鉴定：细菌/酵母等基因组DNA快速纯化方法：1.5ml菌液于EP管中5000rpm离心5min，4，弃上清；细胞裂解裂解液1：A试剂：0.2g NaOH、80ul 0.5M EDTA、40ml H2O，不需要调节ph值，最终ph值大概12.B试剂：40mM Tris HCl ph=5 或者PBS在菌沉淀管中加大约200ul A溶液，悬浮(xunf)菌后在95-100oC煮15min-1h,每10min混匀样品，直到所有样品都裂解（时

10、间,A液体积要摸索）加等体积(tj)的B液中和样品，混匀。裂解(li ji)液2：50 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM EDTA pH 8.0、100 mM NaCl、1% SDS。加适量的裂解液2悬浮细胞后，在95-100oC煮10min-1h，每10min混匀样品，直到所有样品都裂解. （时间,A液体积要摸索）裂解液3： Stock Solution per 100ml2% Triton X-100 10% TX-100 20 ml1% SDS 10% SDS 10 ml100 mM NaCl 2 M 5 ml10 mM Tris, pH 8.0 1 M Tris, p

11、H 8.0 1 ml1 mM EDTA 100 mM EDTA 1 mlDistilled water 63 ml加适量的裂解液3悬浮细胞后，在95-100oC煮10min-1h，每10min混匀样品，直到所有样品都裂解. （时间,A液体积要摸索）加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（P：C：I=25：24：1）彻底混匀。4oC 12000rpm离心5-10min，取上清。加2倍体积的冰异丙醇（-20），彻底混匀12000rpm离心5-10min，去上清。加入500ul 70%乙醇，混匀悬浮DNA沉淀，12000rpm离心1min，小心弃上清，室温干燥。（如果要测序等需要较干净DNA可以重复这一步，最

12、后干燥）加适量(10-20ul) TE溶液回溶，取1ul产物跑0.8%的琼脂糖凝胶检验，测DNA浓度，取适量DNA（10-200ng）进行PCR扩增。霉菌DNA提取方法是（氯化苄）。（1）取在米曲汁培养基上培养36 h的新鲜米曲霉菌株大约6 g左右，按照每管3 g计算。将米曲霉菌株放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨3-4次。取大约3 g研磨碎的粉末装入灭过菌的40 mL的离心管内。提取液（100 mmol/L Tris-HCl pH8.0 + 125 mmol/L EDTA pH8.0）在50的恒温培养箱中预热1 h左右。（2）每个离心管中加入(jir)10 mL提取液，充分混匀，静置

13、2 min。（3）每个离心管中加入(jir)2 mL10 %的SDS溶液(rngy)，上下颠倒混匀后加入6 mL的氯化苄溶液，剧烈振荡。把离心管放入50水浴锅中孵育1 h，期间要不时地颠倒混匀。（4）每个离心管中加入3 M的 6 mL醋酸钠（NaAc），冰浴15 min。（5）10，6000 rpm离心15 min，将上清液移入新的灭菌的40 mL离心管中。（6）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提，10，10000 rpm离心15 min，并将上清液移入新的灭菌的40 mL离心管中。（7）加入100-150 L的RNase A（100 mg/L），37孵育2 h后，用等体积的氯仿/异戊醇

14、抽提2次。（8）加入等体积的冷冻的异丙醇，10，10000 rpm离心5 min。（9）弃上清，用70 %乙醇洗2遍沉淀，最后用无水乙醇再洗一遍，干燥，2 mL水溶解，保存备用，用琼脂糖凝胶验证。1.菌落PCR DNA的制备：挑取新鲜单菌落置于 30l 0.2 SDS 中；漩涡混匀器上混匀 15 秒；90 热激4min；4 13000rpm1min，离心，取上清液 20L 至新的无菌离心管中，-20保藏。2.菌落PCR：挑取新鲜单菌落置于 20l 水中；漩涡混匀器上混匀 15 秒；取5L 作为PCR模板，剩余菌液放-20C保藏。用于酵母菌26S rDNA D1/D2区序列：菌株26SrDNAD

15、1/D2区的 PCR 扩增26SrDNAD1/D2区PCR扩增的引物对为NL1（5-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3）；NL4（5-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3）；Initial denaturation at 94C for 3 min; 36 cycles of 94C for 2 min, 52C for 1 min, 72C for 2 min; final extension at 72C for 7 min, holding at 4C.Jespersen, L., Nielsen, D.S., Hnholt, S., Jakobsen, M.,

16、2005. Occurrence and diversity of yeasts involved in fermentation of West African cocoa beans. FEMS Yeast Research 5, 441e453.用于细菌16S rDNA序列:Primers for the PCR amplication of16S rDNA were selected from conserved regions of the 5-end (16Sd, 5-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3) and the 3-end (16Sr, 5-GGAGGTGA

17、TCCAGCCGCAGGT-3) of the 16S rDNA. For amplication of the 16S rDNA, samples were incubated for 5 min at 94 C and then cycled 35 times at 94C for 1 min,58C for 1 min and 72C for 2 min. The samples were then incubated for 10 min at 72C for a nal extension and maintained at 4C until tested.Ruiz, A., Poblet, M., Mas, A., Guillamon, J.M., 2000. Identification of acetic acid bacteria by RFLP of PCR-amplified 16S rDNA and 16S23S rDNA intergenic spacer. International Journal of Systematic and