分子生物学实验常规技术操作

1、分子生物学实验常规技术操作.质粒提取小提质粒小量快提质粒鉴定：大提质粒：.酶切制备型酶切小量酶切鉴定DNA片段5突出端的补平.琼脂糖凝胶电泳.回收从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段小量胶回收DNA片段试剂盒操作见操作手册无水乙醇沉淀回收.连接一股连接平端动态连接.转化质粒快速转化连接物转化.制普通固体培养板.涂板.挑菌.血清中病毒核酸的提取（蛋白酶K法）哺乳动物细胞单克隆株别离常用溶液、培养基配制.质粒提取：小提质粒：本实验室在常规条件下采用碱裂解法小量提取质粒(1)从平板上挑取单菌落或摇甘油菌(550uL),接种于3mLLB液体培养基中加有相应的抗生素，37c振荡培养至OD2.0以上，但也无

2、需过浓。*通常DH5a菌株摇1214hr;JM10178hr;ER25661012hr*(2)取菌液于管可取未灭菌的新管中，12000rpm离心1530sec,弃上清。通常可取菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理*(3)加入150uL溶液I,振荡使菌体沉淀充分悬浮。务必悬浮完全*(4)加入150UL溶液II,立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。可观察到原浑浊的菌悬液变清变粘*(5)加入180UL溶液出，立即上下颠倒充分混匀710次，不宜太剧烈。可观察到白色团片状沉淀出现。*(6)置冰浴10分钟，也可置于-20C中5min。(7)12000rpm离心8

3、10分钟。(8)在离心过程中可取未灭菌的新管，加入等体积(350400uL即可)酚-氯仿-异戊醇25:24:1董国.；取出苗过色新管，加入2倍体积(780uL即可)的无水乙醇置于-20C黄川一。加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层的Tris-cl保护液*(9)离心完将上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-异戊酉I中，充分混匀。小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中*(10)12000rpm离心45分钟。(11)吸水相，加入已加好的无水乙醇中，颠倒混匀几次。小心不要吸入酚相，没把握时宁愿放弃一些水相*(12)-20C放置515分钟。(13)12000rpm离心10分钟。(1

4、4)迅速弃上清，沉淀用适量70叱醇洗一次，于纸上扣干。小心不要将沉淀洗掉*(15)置于恒温器上干燥(55C)至无色透明或无乙醇气味，一般大约510min。(16)加入3040uL1XT逐冲液溶解沉淀，-20C储存备用。*做完实验请及时收拾实验台.*1.2小量快提质粒鉴定：目前较少采用(1)取培养的菌液1mL,12000rpm离心30s,收集菌体，在纸上扣干残留培养液。(2)用50uL无菌水充分悬浮菌体。(3)每管加入50uL酚-氯仿-异戊醇25:24:1并充分混匀。(4)12000rpm离心10分钟。(5)小心吸取5uL上清上样电泳。(对于插入片段足够大的重组子，其迁移率应低于未插入片段的对照

5、质粒。)*做完实验请及时收拾实验台*1.3大提质粒：(1)从20C保存的甘油菌吸取50uL菌液，接种到34m出LB养基中，37c振荡培养至O及0为。(2)取0.5mL菌液接种到200mLL盼养基中，37c振荡培养至。联。为以上，再加入氯霉素至170ug/mL,37c继续振荡培养1216hr。(3)将摇好的菌液4000rpm离心15min。(4)弃上清，敞开离心管口倒置，尽量让上清全部流尽。(5)用预冷的40mLST沆分悬浮菌体沉淀。(6)4C,4000rpm离心10min。(7)弃上清，敞开离心管口倒置，让上清全部流尽。(8)用预冷的4mLm夜I充分悬浮菌体沉淀。(9)加入新鲜配制的溶液n8m

6、L,上下颠倒几次，液体会变得澄清，置于4c10min。(10)加入预冷的溶液出6mL,上下颠倒混匀后，4c中放置30min。(11)4C,12000rpm离心10min。(12)收集上清，加等体积的异丙醇，4c放置30min。(13)4C,10000rpm离心10min。(14)弃上清，用70%的乙醇洗沉淀一次，室温吹干，溶于1mL1XTE中。(15)加50uLRNaseA,37c作用2小时。(16)加1mLM配制的13%的PEG8000液13%PEG80001.6MNaCl,充分混匀，4c放置30min。(17)4C,12000rpm离心15min。(18)吸去上清，用400uL1XTE溶解

7、沉淀。(19)力口1/4体积4MLiCl,室温放置5min,12000rpm离心5min。(20)取上清，用酚、酚氯仿-异戊醇各抽提一次。(21)将水相转入一新的Eppendof管中，加入1/10体积4MLiCl,2倍体积的无水乙醇,20C放置30min。(22)4C,12000rpm离心10min,去上清，70%的乙醇洗沉淀一次，室温晾干。(23)加200uL1XTE溶解沉淀，测定质粒DNA勺浓度后于20c保存备用。*做完实验请及时收拾实验台.*2.酶切：制备型酶切：（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入以下成分混合：注意：酶切时酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅速

8、，酶不要在空气中暴露过久;要尽量保持低温，不要用手直接接触储存管上装酶的部位;用完后要盖紧放回原处l罢川断跑顼有回题时地愁.署理员.xxy二注意：酶切时用酶量不能过大，过大会影响酶切并且可能会有星号效应。引起酶切效果不佳的原因一般多是质粒没有提好。除个别特殊位点或内切酶外,酶切时间均不宜过长。 TOC o 1-5 h z DN肉品30uL10X反应缓冲液*6uLRnaseA34uLddH2O适量限制性内切酶A1uL（限制性内切酶B1uL）反应总体积5070uL*为了保证酶切效率（至少在75%上），需选用合适的反应缓冲液，不同公司的酶切反应缓冲液基本上可以通用。但需注意有的要另外加BSA（10X

9、和100X的都有）。（2）37C反应34小时（可依据所使用酶的需要，选用合适的酶切时间和温度）。取12uL电泳鉴定。*做完实验请及时收拾实验台*小量酶切鉴定（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入以下成分混合：注意:酶切时酶要在最后才加,一一加酶时要用新的枪头，动作要迅速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原处;一要用JSH或有回题时:请我管理员.xxy.屋注意:酶切时用酶量不能过大，过大会影响酶切并且可能会有星一号效应。引起酶切效果不佳的原因一般多是质粒没有提好。除个别特殊位点或内切酶外，酶切时间均不宜过长.注意：做小量

10、酸切鉴定时要尽量选用.较为一廉价一的酶.DN肉品5uL10X反应缓冲液*RNaseA0.5uLddH2O1限制性内切酶A0.1uL（限制性内切酶B0.1uL)反应体积1520uL*请根据保证酶切效率（至少在75刈上）的需要选用合适的反应缓冲液，不同公司的酶切反应缓冲液基本上可以通用。但需注意有的要另外加BSA（10X和100X的都有）。（2）37C反应23小时（可依据所使用酶的需要，选用合适的酶切时间和温度取12uL电泳鉴定。*做完实验请及时收拾实验台*DN射段5突出端的补平：（1）在灭菌过的新0.5mLEppendorf管中加入以下成分混合：注意：酶要在最后才加，加酶时要用新的枪头，动作要迅

11、速，酶不要在空气中暴露过久；要尽量保持低温，不要用手直接接触储存管上装酶的部位；用完后要盖紧放回原处；要用新酶或有问题时请找管理员xxy。欲处理的DNA羊品2ug10 xKlenowbuffer34uL10mMdNTP2uLddH2O适目.里DN麋合酶I（Klenow大片段）510U反应体积30八-40uL（2）37C反应1小时后，低熔点琼脂糖凝胶回收。做完实验请及时收拾实验台*3.琼脂糖凝胶电泳：（1）制备凝胶：根据需要，在指定的三角瓶中配制50/100mL特定浓度的琼脂糖凝胶。首先在电子天平上称取一定量的琼脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，加入100mL1XTAE再加入34uL澳化乙锭（EB）,

12、混匀，在微波炉中煮化（大约45min）,混匀后倒入插好样品梳的凝胶槽中，凝固后备用。*澳化乙锭（EB有潜在的致癌性，操作时要戴手套，并且注意不要污染其它操作区*在微波炉中煮化时要小心不要让凝胶暴沸*倒胶时不要倒太厚，一般可插入梳子5mme右即可*倒回收胶要使用专用的样品梳和凝胶槽（2）待胶凝固后，小心拔去梳子，拔出时注意不要破坏胶孔。（3）用刀片切下所需的胶块，放入加有足够电泳缓冲液（1XTAE）的电泳槽中，缓冲液面高于凝胶外表35mnSP可。*注意电泳时使用的是 1XTAES冲液，而母液是50X的，配制时要留神*在放入凝胶要上样前，最好 检查一下样品孔是否有破损泄漏，尤其 是上回收样品之前

13、*（4）可在一干净手套上点滴适量 （13uL）的3X澳酚兰上样缓冲液（卷绿鱼），用枪移取适 量的样品（110uL）与滴加好的澳酚兰上样缓冲液混合（可观察到混合液变为 1鱼）,再将混合液小心加入胶上的样品孔中。*上样要迅速准确，上样量不要过大以致漫出样品孔*假设样品要求无污染，可使用新的灭菌枪头上样*假设样品无严格要求（如用来做小量酶切鉴定的样品），可用一个枪头多次上样，但每次上样前在电泳缓冲液中洗几下* 接通电极进行电泳，电压一般可在140V200V。*注意要接对正负极，核酸是由负极向正极方向跑的*打开及关闭电泳仪时请特别注意，不要用沾染有EB的手套接触电泳仪 *当澳酚兰迁移至足够距离时 （至

14、少1cm）,关闭电源，取出胶块放到紫外灯下观察。在紫外灯下观察时要注意 保护眼睛，不要用裸眼直接观察 *一般质粒样品电泳时，电泳迁移率从跨快倒慢依次是：RNA 澳酚兰、cccDNA LcDNA OcDNA那些始终跑不出孔的样品多是染色体观察结束后，要 及时处理 凝胶及手套，严禁随处抛弃*做完实验请及时收拾实验台*4.回收：*别离不同大小的DN射段请选用合适浓度的琼脂糖凝胶*琼脂糖凝胶（）线性DNA勺有效别离范围（kb）0.523010763(6)24.1从低熔点琼脂糖凝胶中回收 DN射段将已经电泳确定的可回收的酶切产物在食道这度一的回收用琼脂糖凝胶中进行电泳。最好换用新的电泳缓冲液,即1XTA

15、E*(2)当澳酚蓝跑到一定距离后(至少2cm以上)在长波紫外灯下观察，用道选过的刀片在目的片段前切下一与目的片段同长，宽度适当(一般1cm右)的胶块。不要忘记在胶下垫一个新的塑料手套防止污染*小心不要将回收胶切裂，同时注意与目的带相邻的切面要尽量平整*(3)将切好的回收胶块放在原回收胶槽内，在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶，待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。*小心低熔点琼脂糖凝胶块与原回收胶块的交界面易断裂(4)待目的带完全进入低熔点琼脂糖凝胶后，在长波紫外灯下用溃选过的刀片切下含有所需DN型的凝胶条，置于新的灭菌过的管中，力口300uLTE。(5)65C水浴10min或更长使胶块完金融

16、化一。(6)立即加入等体积(300-350uL)Tris-Cl饱和酚，摇晃混匀。12000rpm离心5min。(8)小心将水相移置另一Eppendof管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，摇晃混匀。*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相(9)12000rpm离心5min。小心将水相移置另一Eppendof管中，加入加体积(780uL即可)预冷的无水乙醇。*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相置液氮3分钟，取出后可于-20C放几分钟。小心厘止堂壬爆裂。(12)12000rpm离心10min。(13)(14)迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无

17、水乙醇后清洗后置于恒温器上干燥(55C)510min至无乙醇气味，再加入20uLddH2O溶解。取2uL电泳定量后20c储存备用。做完实验请及时收拾实验台*4.2小量胶回收DNAt段试剂盒操作见操作手册(1)将已电泳确定的可回收的酶切产物或其它产物在合适浓.度.的回收用琼脂糖凝胶中进行电泳。要换用新的电泳缓冲液，即1XTAE*(2)当澳酚蓝跑到一定距离后(至少2cm上)在长波紫外灯下观察，用清洗过Eppendof管。回收胶下要垫二个一新的塑料壬套防止污染*(3)每100mgg胶加入300uL/450uLS1液，55OC温育10min,每2min颠倒一次。务必完全溶解*(4)加入1/3体积(10

18、0uL/150uL)异丙醇，混匀，55OC,温育1min。(5)将混合液移入吸附柱，高速(10000rpm)离心1min,弃去收集管液。(6)往吸附柱中加入450ulW1,静置1min,高速离心15sec,弃去收集管液。(7)重复步骤6一次，但无需静置。(8)弃去收集管液后再高速离心1min。Eppendof管，在吸附膜中央滴入3040ulT1液或ddHO,室温静置1min,当用ddHO解时可在370G置5min。(9)高速离心1min,弃去吸附柱。(10)取2uL电泳定量后20c储存备用。*做完篆验适及时收捡实验台*目的片段所需量(ng尸载体量(ng) x目的片段长度x 3/载体长度(2)2

19、5 C (SmaI)或37 c (EcoRV/HincII)作用34小时，将内切酶及连接酶灭活后转化。*做完实览请及.M收拾实览台.*6.转化6.1质粒快速转化：(1)根据需要，从超低温冰箱中 迅速取出一管感受态细胞，用手捂化后，置于冰浴中10min 以上，并请注明取出的日期时间。不要取出后立即使用或使用已放置 6hr以上的感 受态细胞。(2)Eppendorf管，先吸取20uL感受态细胞，再加入质粒 (假设质粒浓度大，只要枪头蘸 一下即可，假设低可取 12uL用于转化)与之混合，混匀后冰浴15min。*小心不要污染 *(3)42 C热休克90120sec,取出迅速置冰浴中 2min。(4)加

20、入200uL LB培养基无抗性，37 C振荡培养15-30min。(5)取相应抗性的平板置于 37 c预热。(6)振荡培养1530min后取100uL菌液涂板。(7)37 C培养适当时间(菌株不同，培养温度和时间均有不同)。通常 DH5a 菌株培养 12 14hr;JM101 7 8hr;ER2566 10 12hr； BL21 9-11hrGI724 30 C培养 2024hr(IMC 平板)4.3无水乙醇沉淀回收：(1)将已确定的可回收产物溶于加有300uL1XT冲液的灭菌过的新管。(2)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，摇晃混匀。(3)12000rpm离心5min。(4)小心将水相移置另一灭

21、菌过的新管中，加入3倍体积(780uL即可)预冷的无水乙醇。*小心不要吸入下层杂质及酚相，没把握时宁愿放弃一些上层水相*(5)置液氮3分钟，取出后可于-20C放几分钟。小心防止管子爆裂。(6)12000rpm离心10min。(7)迅速弃上清，一般在管底会有针尖大小的沉淀物，小心用无水乙醇后清洗后置于恒温器上干燥(55C)510min至无乙醇气味，再加入20uLddH20M解。(8)取2uL电泳定量后20c储存备用。*做完实验请及时收拾实验台.*5.连接：一般连接：(1)在灭菌过的新0.5mLEppendof管中加入以下成分混合:J目的基因*10XT4LigaseBuffer1T4DNM接酶1u

22、LddH2O1015uL平端动态连接(1)在灭菌过的新0.5mLEppendof管中加入以下成分混合线性化载体(平端酶SmaI/EcoRV/HincII处理200ng目的片段适量做完实验请及时收拾实验台.*6.2连接物转化：(1)根据需要，从超低温冰箱中 迅速取出一管感受态细胞，用手捂化后，置于冰浴中15min 以上，并请注明取出的日期时间。不要立即使用或使用已放置 6hr以上的感受态细 胞。(2)在超净工作台内取一转化用1.5ml Eppendorf管，吸取40uL感受态细胞和5uL连接物混合，混匀后冰浴30min。 TOC o 1-5 h z 10XT4LigaseBuffer2uL相应平

23、端酶(SmaI/EcoRV/HincII)58UT4DNAt接酶10UddH2O适量反应总体积20uL*小心不要污染*(3)42C热休克90120sec,取出迅速置冰浴中2min。(4)加入360uLLB培养基无抗性，37c振荡培养4060min。假设连接物需用蓝白斑来鉴定，则在菌液涂板前30min,需预先在平板上均匀涂布上适当浓度的X-gal与IPTG,并在37c中正放30min。*(5)取相应抗性的平板置于37c预热。(6)振荡培养4060min后涂布平板。(7)37C培养适当时间(菌株不同，培养温度和时间均有不同)。通常DH5a菌株培养1214hr;JM10178hr;ER2566101

24、2hr；BL219-11hrGI72430C培养2024hr(IMC平板)做完实验靖及时收检第览育.*7.制普通固体培养平板：(1)固体琼脂培养基的配制：本实验室常用的是LB固体琼脂平板，浓度为1.5%,即在100mLLB液体培养基中加入的琼脂，灭菌后可使用。(2)使用时取一瓶灭过菌的固体琼脂培养基，放在电炉上小心煮化。在电炉上煮化时一定要小心看守，防止其暴沸*有时会有部分固体琼脂沉积在瓶底，在煮化时要小心不要煮焦*(3)将固培冷却至4560C,在超净工作台内按比例加入需要的抗生素，混匀。 TOC o 1-5 h z 固培煮化后，可在流水下冷却，但须小心玻璃会卒冷爆裂*当冷却至手摸不烫时即可，

25、冷却过头易于凝固*(4)在超净工作台内按比例加入需要的抗生素，混匀后，将培养基倒入已灭菌过的平皿内，厚度适当。培养基不要倒太厚，一般35mmp可，也不要过薄，涂板时易涂破*(5)平皿可正放在超净工作台内，待其冷却凝固后使用或放入冰箱4c储存备用。在放入冰箱4c前，要在平板上标记清楚所加的抗生素*做完实验请及时收拾实验台8.涂板：(1)假设所要使用的平板储存于冰箱4C,则使用前须预先取出放在室温或37C中预热段时间。*取用平板时一定要注意抗性*平板预热时最好倒置*(2)在超净工作台内用枪将所要涂布的菌液移入平板。质粒转化一般只要涂100uL左右的菌液，连接物涂200400uL*(3)将涂布器先在

26、酒精灯的外焰上灼烧，再浸入乙醇中，取出后再通过灯焰，燃尽其上的乙醇，待其冷却后方可使用。如平板的盖子内面上覆有水珠，可用于冷却涂布器*涂板时不要心急，一定要等涂布器充分冷却后方可使用*(4)用涂布器将平板上的菌液涂布均匀，平板倒置放在培养箱中培养，除GI724(30C)外，其它菌株均在37c中培养。做完实验请及时收拾实验台.*9.挑菌：(1)待平板上的菌落长至足够大即到达可挑的水平。(2)在超净工作台中，在灭菌过的试管内倒入34mLM菌过的培养基，培养基根据需要 TOC o 1-5 h z 预先加入抗生素(由菌落所携带的质粒上的抗性基因决定)。抗生素要按比例加入培养基，并要加了抗生素的培养基上

27、做清楚标记，没有用完的培养基要封好放入冰箱4C,不要放在外面*请尽量使用冰箱内已加好抗生素的培养基*(3)用镣子夹取灭菌过的牙签挑取平板上的单菌落，在试管内的培养基中蘸洗几下，旋紧管盖后再将牙签丢弃于超净台外的收集桶内，并请您扔准。挑菌时不提倡将牙签直接投入培养基中*挑菌时一定要挑清晰正常的单菌落*挑过菌的牙签一定不能留在超净工作台中*(4)挑菌后请将装灭菌牙签的小烧杯封好，并及时将工作台清理干净。(5)接种过菌落的试管放在摇床中在合适温度下摇动培养，摇速一般170230r/min。试管要在摇床放好，有适当的倾斜角度(45。左右)*要注意不同的菌株和摇菌目的，可能需要不同的温度和摇速。*做完实

28、验请及时收拾实验台*10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)：(1)将血清装入新的灭菌过的1.5mLEppendorf管，每管200uL。*使用血清，尤其是未灭活的血清时要注意安全，不要污染环境*一旦发生血清污染环境，请立即用84消毒液处理*(2)在每管中加入STE156uL10%SDS40uL100XPro-K4uL然后在56c中水浴2-3小时，每几分钟(一般510min)轻轻摇晃混匀一次。 TOC o 1-5 h z 管子一定要仔细盖严，防止泄漏及外面的水进入*(3)加入400uL的酚-氯仿-异戊醇，摇匀后静置几分钟(510min),不宜剧烈。(4)12000rpm离心10min。(5)小

29、心将上清取出，加入两倍体积以上(780uL即可)的无水乙醇和终浓度为0.2M的NaAc(40uL),置于液氮中3min。小心不要吸入中间的蛋白和下层的酚相*(6)取出后可先置于-20C中放2分钟以防止管子爆裂。12000rpm离心10min。(8)迅速弃去无水乙醇，再用无水乙醇洗一下(也可不洗)，最好用灭菌枪头吸干管内液体*(9)在恒温器(55C)干燥5min左右至无乙醇气味，再加入20uLddH2O溶解。-20C储存备用。使用时不要频繁的反复冻融*操作过程中要严防污染*做定头擅道丝匣也邕遑挽食*哺乳动物细胞单克隆株别离：(1)把转染72hr后的细胞从六孔板中的用Verson液消化洗下，经稀释

30、后转入50mL螺口玻璃培养瓶中培养，待细胞生长至基本贴壁时再加入含作用浓度为400ug/mLG418的完全培养基继续培养。以23天为间隔换液，如此培养一星期后可观察到有大量细胞死亡，相应降低G418压力继续培养23星期后，可观察到有细胞克隆形成。(2)将已形成细胞克隆的培养瓶置于显微镜下，观察克隆的位置，并用记号笔将其标出。(3)用镣子夹取灭菌过的小滤纸片，在Verson中蘸湿后将其覆盖在细胞克隆上，520s后取出在加有完全培养基(600uL/孔)的24孔板中刷洗数次，将附着上的细胞洗下。(4)将转移有细胞克隆的24孔板置于5%C所养*f中37c进行培养。(5)待24孔板中的细胞生长并到达80

31、%A上满底后，分别取细胞培养上清进行ELISA检测。(6)将经检测可表达目的基因的细胞克隆转入50mL螺口培养瓶中继续培养，并在适当的时候进行传代换液，扩增细胞，进行进一步的鉴定。常用溶液、培养基配制I*美苴LB口乔9.每1000mL加分析纯NaCl10g,蛋白月东10g,酵母粉5g,用ddHO配制，再用10MNaOHpH至(1000mL一般力口450ul),高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。固体培养基：LB培养基中加入琼脂至,高压灭菌后使用。溶液I：葡萄糖50mmol/L,EDTA10mmol/L,Tris-HCl25mmol/L,。溶液II：,SDS1%,用ddH2O现配现用。溶液出:取5mo