染色体转移技术

1、染色体工程2021/4/261什么是染色体工程？染色体工程（chromosome engineering） 是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。2021/4/262 染色体工程包括植物染色体工程、动物染色体工程、人工染色体。从两个层面展开: 1、从细胞水平诱发染色体数目的改变 2、从染色体水平针对染色体本身操作2021/4/263目前对染色体操作的主要方法有： 有性杂交、染色体交换、易位、添加、染色体显微切割和微克隆、PCR扩增等。2021/4/26

2、4染色体工程的发展经历天然染色体片段（如染色体介导的基因转移）天然染色质片段（如染色质介导的基因转移）DNA重组技术产物-人工染色体 酵母人工染色体（YAC） 细菌人工染色体（BAC） 哺乳类人工染色体（MAC）人工染色体2021/4/265染色体是基因的天然载体。这个载体上，目的基因与他两侧的基因或序列是天然的遗传连锁，这种天然的片段进入受体细胞后，可以长时间存在，对目的基因有强大的保护作用。提高染色体工程的关键技术是把着丝点分离与克隆、然后与目的基因重组，并与组蛋白合成一个染色体片段。 天然染色体片段2021/4/266一、染色体介导的基因转移McBride和Ozer第一次令人信服地证明纯

3、化的染色体片段是对真核细胞进行基因转移的理想的和天然的载体。受体细胞通常缺乏某一基因的正常功能供体细胞的同源染色体则具有该基因的正常功能已使用的基因有：HPRT、嘧啶激酶基因、乳糖激酶基因、抗甲氨蝶呤（MTX）基因、抗鹅膏覃碱基因2021/4/267 染色体介导的基因转移(CMGT)可把一些紧密连锁的基因从一个细胞转移至另一细胞。当把分离到的中期染色体同完整细胞混合时，供体染色体的一部分可被某些细胞摄取并加以表达。如果受体细胞缺乏该染色体所携带的功能性基因，而后者又是该细胞在选择性条件下生存所必需的，转移就可得到证实。因此，在选择性条件下生存的基因转移克隆，其核内一定有必需的供体基因参入，而且

4、必须能表达其基因产物。被转移的染色体物质称为转移基因组（transgenome），而表达这些基因的细胞则称之为转化株（transformant）。 2021/4/268 1、染色体的分离技术 染色体分离技术是指通过流式分拣仪分离染色体或者在显微镜下对特定染色体或染色体的特定区段进行分离，随后进行DNA体外直接酶切后克隆或者扩增（PCR）后克隆，以构建特定染色体或染色体特定区段的DNA文库的细胞遗传学和分子遗传学结合的桥梁技术。其优点是能够根据研究者的需要分离任意一条染色体或染色体的特定片段，快速高效地建立相应的DNA文库。该技术于1981年首次在果蝇中应用获得成功 。2021/4/269 1、

5、染色体的分离技术哺乳动物细胞培养秋水仙碱处理细胞使其处于分裂中期低渗处理，加皂苷，破裂细胞TMS液处理，离心，收集染色体染色体储存于含20甘油的TM液中TMS缓冲液：含0.05M Tris，3M MgCl2，0.2M蔗糖，pH：7.4秋水仙素可与微管蛋白二聚体结合，阻止微管蛋白转换，抑制有丝分裂，能破坏纺锤体，使细胞停止于有丝分裂中期，从而导致细胞死亡 。皂苷有使红细胞破裂的作用，称溶血性 。2021/4/26109、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022/7/152022/7/15Friday, July 15, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022/7/152022/

6、7/152022/7/157/15/2022 8:06:56 PM11、人总是珍惜为得到。2022/7/152022/7/152022/7/15Jul-2215-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。2022/7/152022/7/152022/7/15Friday, July 15, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022/7/152022/7/152022/7/152022/7/157/15/202214、抱最大的希望，作最大的努力。15 七月 20222022/7/152022/7/152022/7/1515、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 222022/7/1

7、52022/7/152022/7/157/15/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/152022/7/1515 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022/7/152022/7/152022/7/152022/7/15 微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项利用微细胞将外源染色体转入受体细胞的技术。该技术是在细胞融合的基础之上发展起来的，是细胞融合技术的进一步细化，在当代生物的若干领域里得到广泛的应用。一些肿瘤抑制基因、端粒酶抑制基因、诱导衰老基因以及DNA修复基因都是通过MMCT技术取得细胞内识别和定位，由此促进了针对这些基因的功能研究，

8、并为相关疾病的治疗提供了依据。同时，MMCT技术也为其他领域如表观遗传学、基因组印迹、哺乳动物人工染色体等方面的进一步研究提供了有力的手段。 2、染色体转移技术2021/4/26129、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022/7/152022/7/15Friday, July 15, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。2022/7/152022/7/152022/7/157/15/2022 8:06:56 PM11、人总是珍惜为得到。2022/7/152022/7/152022/7/15Jul-2215-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。2022/7/152022/7/15

9、2022/7/15Friday, July 15, 202213、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022/7/152022/7/152022/7/152022/7/157/15/202214、抱最大的希望，作最大的努力。15 七月 20222022/7/152022/7/152022/7/1515、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。七月 222022/7/152022/7/152022/7/157/15/202216、业余生活要有意义，不要越轨。2022/7/152022/7/1515 July 202217、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022/7/152022/7/15202

10、2/7/152022/7/152、染色体转移技术染色体悬液与受体细胞混合生长于非选择培养基中持续3代，加多聚L鸟氨酸可提高染色体进入受体细胞的几率约3天后移入选择培养基筛选与鉴定*多聚L鸟氨酸可以改变本来都带负电荷的原生质体或外源 DNA表面电性 ,使其中之一带正电荷 ,从而达到原生质体和外源 DNA正负相吸 ,并且促进外源DNA进入到原生质体中 。2021/4/2614非选择性分离培养基（ non-selective isolation medium）：对微生物没有选择性抑制的分离培养基，营养成分齐全，无抑制成分（如牛肉膏蛋白胨培养基）。选择培养基：是指通过培养混合的微生物，仅得到或筛选出所

11、需要的微生物，其他不需要的种类在这种培养基上是不能生存的。 鉴别培养基：是通过化学试剂显示出培养基上混合生长的微生物中有某种微生物。 2021/4/26153、被转移染色体片段的大小 大约15的染色体受体细胞，在光学显微镜下可见到各种大小的染色体片段。光学显微镜下见到的最小染色体片段是双微体（1000kb）。*双微体（doubleminutechromosomes，DMs）是基因扩增的主要细胞遗传学标志，是染色体外遗传单位的一种主要存在形式。大量研究表明，双微体与基因组不稳定、恶性肿瘤、细胞耐药及衰老密切相关。 2021/4/2616染色体介导的基因转移的主要作用一是用于染色体内的基因作图二是

12、用于分离或克隆一些特殊的基因虽然DNA序列分析技术和基因克隆技术高度发展的后基因组时代以上用途显得无用，但染色体片段作为真核细胞基因的天然载体，仍是诱人的课题。2021/4/2617二、染色质介导的基因转移染色质作为转基因载体的提出染色体介导基因转移由于不能控制所转基因的染色体或染色体片段的种类、数目和大小，故不能有选择的转移目的基因。1986年李振刚等提出了以染色质为介导的基因转移的工作。用活性模板染色质来转移预期基因（基因群），从而弥补了基因工程的不足。与DNA相比，染色质是一种更为天然和稳定的转基因载体，便于整合，是基因打靶的理想载体。2021/4/2618活性模板染色质在生命活动的一定

13、时空，只有一定数量的基因表达，这些正在表达的基因在染色质中的区域活性基因这些正在表达的基因 如果从一定组织提取活性染色质，就会得到该组织的全部基因，包括细胞中转录极少次数的基因。 所以，对于真核生物来说，与DNA相比染色质片段是一种更为天然和更为稳定的转基因载体。2021/4/2619活性染色质作为基因载体的特点 染色质工程能选择性的转移基因，并可在不知道目的基因序列或其探针的情况下进行。且可获得一个复杂系统的全部活性基因，可对所有活性基因进行克隆（如YAC克隆，克隆等）。2021/4/2620活性染色质作为基因载体的鉴定基因的鉴定：用已知基因的染色质片段进行共制备用所得的活性染色质DNA与家

14、蚕染色质进行染色体原位杂交2021/4/2621三、人工染色体染色体作为基因转移的天然载体，可转移连锁的基因群，故在此基础上发展了人工染色体。人工染色体（artificial chromosome）指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。 2021/4/2622现正在研究的人工染色体有： *酵母人工染色体（YAC，1000kb） *细菌人工染色体（BAC，300kb） *哺乳类人工染色体（MAC） P1派生人工染色体（PAC ） 人类游离人工染色体（HAEC）。 三、人工染色体2021/4/2623 天然染色体基

15、本功能单位包括： 复制起始点，保证了染色体复制； 着丝粒保证了染色体分离； 端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保证了染色体的稳定存在。 人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外重组技术分离了天然染色体的基本功能元件并将它们连接起来，从而构成了人工染色体。相比于其他复制子而言，染色体要大得多。 原理 2021/4/2624酵母人工染色体（YAC）是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入 100-2000kb的外源DNA片段。 YAC是有酵母的自主复制序列、着丝点、四膜虫的端粒以及酵母选择性标记组成的酵母线性克隆载体。左臂含有端粒、酵母筛选标记Trp1、自主复制序列ARS和着丝

16、粒，右臂含有酵母筛选标记Ura3和端粒，然后在两臂之间插入大片段DNA构成的。 2021/4/2625 YAC载体基本序列元件： 酵母染色体DNA自主复制顺序（ARS）： 负责DNA复制酵母染色体的着丝粒顺序（CEN）： 保证酵母细胞分裂时染色体的分配酵母染色体的端粒顺序（TEL）： 维持染色体结构的稳定性（两端各一个） 选择标记：用于重组克隆的筛选 pYAC4是一个大肠杆菌穿梭质粒，含有Amp大肠杆菌筛选标记ARS：autonomously replicating sequence2021/4/2626YAC克隆系统的特点: YAC作为可提供大片段DNA的方法，简化了构建染色体延伸区域图谱和

17、分离完整基因的过程（200500kb，甚至1000kb） 用酵母为宿主重新构建大的人类基因区段，可将小的重叠的YAC变成一个大的YAC。 酵母作为一种真核生物，为其它真核的DNA提供了更合适的环境。2021/4/2627YAC构建示意图2021/4/2628完整的染色体DNA的提取基因组DNA酶切大片段的获取YAC载体臂的制备YAC臂与目的DNA大片段的连接YAC基因库的保存YAC基因库的鉴定目的基因YAC克隆的筛选目的基因YAC克隆的鉴定YAC克隆技术简介2021/4/2629 YAC的主要用途是：(1)YAC克隆重叠群是物理图谱的主要框架。它不仅可容纳大片段的外源DNA ，而且在构建基因组

18、文库时需要较少的克隆。2021/4/2630 YAC的主要用途是：(2)用YAC克隆构建的物理图谱在复杂的生物基因组分析和DNA测序中发挥着重要作用。目前，用YAC提供大片段DNA构建染色体图谱的技术已在人类、植物、昆虫、鸟类、两栖类等动物中得到广泛应用，相比于早期的DNA片段载体，YAC是容纳大片段外源DNA的首选载体。2021/4/2631YAC的主要用途是：(3)在基因功能研究中，基因嵌入及转基因技术都采用了YAC克隆系统。通过YAC嵌入的基因不仅片段长，而且嵌入的基因更适于体内表达，并有利于基因保持其固有的空间构象和功能的发挥。 2021/4/2632YAC的缺点：1.插入片段大，稳定

19、性较差，不易操作2.插入的大片段常发生缺失，使文库不完整3.YAC与酵母天然染色体分子结构相似分离时难与天然染色体分开4.文库中的嵌合现象严重5.因插入片段大。往往发生序列重排，造成序列错乱。2021/4/2633四、细菌人工染色体（BAC）1992年Shizuya利用F因子的复制点和氯霉素抗性标记基因，在F质粒（pMBO131）基础上构建了第一代BAC人工染色体。BAC是以大肠杆菌的F因子的重要位点及基因为主体的高容量的人工载体。（可克隆350kb，在重组缺陷型（REC）宿主菌只有1个拷贝）2021/4/2634F因子又称致育因子，是一个100kb的质粒，能整合到宿主染色体中，并能高频率的转

20、移遗传标记。因低拷贝特性使其重排和嵌合程度低。且F因子呈闭环结构，可以用常规技术从大肠杆菌中分离。2021/4/26351、BAC载体的结构 新一代BAC载体为7.4kb的还状质粒，主要结构有：F因子的parA，parB，parC基因 保证低拷贝的BAC质粒在大肠杆菌分裂时均匀分配到子代细胞。起始oriS基因， 严密控制，决定低拷贝和起始解旋酶基因repC， 易于DNA复制和决定复制方向2021/4/2636选择标志基因Cmr 氯霉素抗性基因lacZ基因 颜色鉴别重组子，外源基因插入其中loxP和cosN位点 易于克隆DNA回收和造作2021/4/26372、BAC基因组文库的构建BAC载体的

21、制备 1.环状BAC DNA的分离 2.环状BAC DNA经酶切（HindIII）线性化 3.去磷酸化反应高分子量基因组DNA的制备 1.大分子量HindIII酶切片段的制备 2.脉冲电泳选择酶切片段BAC克隆及其鉴定电激转化2021/4/2638五、哺乳类人工染色体 哺乳类人工染色体（MAC）则是以哺乳动物细胞作为宿主细胞的人工染色体技术，作为异源DNA片段的载体，比YAC容量大。 哺乳类人工染色体（MAC）比YAC大23倍。令人遐想的是，人类人工染色体（HAC）可用作基因治疗。 MAC的优点：能容纳更大的基因，维持基因的拷贝数，没有副作用，能长期调控基因表达。2021/4/2639YAC和

22、MAC应用于基因治疗领域是一种理想的基因转移新载体，有以下优点： 1）可携带的外源基因容量大，包装容量可达500600kb，可以满足几乎所有的单个基因的基因组DNA的需要。 2）可以携带较长片段的基因表达调控顺序，能够较好地调节基因表达水平以及基因的靶向表达。 3）外源基因存在于人工染色体中，可以不整合到细胞基因组中，因而不会激活原癌基因或使其它有功能基因失活，而且理论上能够在细胞中较稳定地存在。2021/4/26409、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。15-7月-2215-7月-22Friday, July 15, 202210、低头要有勇气，抬头要有低气。*7/15/2022 8:06:56 PM11、人总是珍惜为得到。15-7月-22*Jul-2215-Jul-2212、人乱于心，不宽余请。*Friday, July 15, 202213