分子生物学核心笔记(共16页)

1、医学分子生物学 九阴真经PAGE PAGE - 17 -第一章第八章基因(jyn)genes：基因是负责(fz)编码RNA或一条多肽链DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列及插入序列。是决定遗传性状的功能单位。结构(jigu)基因structure genes：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。基因组genome：一个细胞或病毒的全部遗传信息。（细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。）真核生物基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列，包括编码序列和非编码序列。GT-AG法则：真核生物基因的外显子与内含子接头处都有一段高度保守的一致性

2、序列，即：内含子5端大多数是以GT开始，3端大多是以AG结束。端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。端粒DNA由重复序列组成，人类端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC.操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位。所转录的RNA为多顺反子。操纵元件：是一段能够被不同基因表达调控蛋白质识别和结合的DNA序列，是决定基因表达效率的关键元件。顺式作用元件：是指那些与结构基因表达调控相关

3、、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、反应元件和poly(A)加尾信号。反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。蛋白质折叠 翻译后的蛋白质需经过一系列加工修饰才能转变为有天然构象和生物功能的蛋白质。新生肽链在翻译过程中或翻译后经过盘曲折叠形成天然构象过程。启动子：是能够被RNA聚合酶特异性识别并与其结合并开始转录的核苷酸序列。（TATAbox、CAATbox、GCbox）增强子enhancer：是一段短的DNA序列，其中含有多个作用元件，可以特异性地与转录因子结合，增强基因的转录

4、活性。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)即每一个mRNA分子带有几钟蛋白质的遗传信息（来自几个结构基因），利用共同的启动子及终止信号，组成“操纵子”的基因表达调控单元。病毒基因组的特点：一、：种类单一；病毒的核酸通常是DNA分子或者是RNA分子。二：RNA病毒基因组有单、双链和正、负链之分。根据是否可以作为mRNA模板，指导蛋白质合成，分成正链RNA病毒和负链RNA病毒两大类。1、单股正链RNA病毒基因组可以作为mRNA行使模板功能：病毒颗粒中的RNA进入宿主细胞后，可直接作为mRNA，翻译出所编码的蛋白质，包括衣

5、壳蛋白和病毒的RNA聚合酶。然后再病毒RNA聚合酶的作用下以病毒基因组RNA为模板合成出负链，在以负链为模板复制病毒RNA，并以复制的病毒RNA和衣壳蛋白自我装配成为成熟的病毒颗粒。这些病毒称为单股正链RNA病毒。2单股负链RNA病毒需要先合成与其互补的MRNA：先以病毒基因组RNA为模板转录生成互补RNA，再以这个互补RNA作为mRNA翻译出遗传密码所决定的蛋白质。3、双链RNA病毒基因组含有正、负两条RNA链。4、部分RNA病毒基因组可以被反转录为DNA：有一类特殊的单股正链RNA病毒，即逆转录病毒，在这些病毒颗粒中带有依赖RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶，能使RNA反向转录生成DNA。逆

6、转录病毒基因组一般包括三个基本的结构基因，即：gag,pol,env，分别编码核心蛋白、逆转录酶和膜蛋白。三、DNA病毒基因组有环状DNA分子和线性DNA分子。四、其他：形式多样、大小不一、基因重叠；、动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；具有不规则的结构基因；基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；无帽状结构；结构基因没有翻译起始序列。原核(yun h)基因组的特点：一、原核生物基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成；二、操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一：原核生物的绝大多数结构基因按功能相关性成簇地串联(chunlin)排列与染色体上，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启

7、动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号构成一个基因表达单位，即操纵子结构。一个操纵子只含一个启动序列和数个可转录的结构基因。在同一个启动序列控制下，操纵子可转录出多顺反子mRNA。三、基因密度非常高，基因组序列中编码区所占的比例较大。可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒。重复序列很少。四、在原核生物基因组中的非编码区内主要是一些调控序列。五、基因一般是连续的，无内含子；六、细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象。转座因子的类别和遗传(ychun)效应：细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象。1、原核生物转座因子可以分为：插入序列、转座子、Mu噬菌体。2、转座因子的几个遗传效应。转座因子的转

8、座不是本身的移动，而是由转座因子复制出一个新的拷贝转移到基因组中的新位置上去。新的转座因子转到靶点后，靶点序列会倍增为两个靶点序列，并分别排列在转座因子的两侧，形成同向重复序列。在转座过程中能够形成共同体。转座因子转座后能促使染色体畸变。转座因子可以从原来的位置上切除，这个过程成为切离。转座可引起插入突变。给受体基因组增添了新的标志基因。真核基因组的特点：真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；基因组由染色体DNA和染色体外DNA组成。真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；基因组中非编码区多于编码区；真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和

9、内含子镶嵌而成；存在大量的重复序列；功能相关的基因构成各种基因家族；还存在一些假基因存在可移动的遗传因素；体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。转座子（transposon,Tn）这是一类长度在200020000bp之间较大的转座因子，如Tn1681 Tn420.它们除了带有与转座有关的基因以外，还带有其他基因，如Tn903 Tn5带有卡那霉素抗药基因等。质粒plasmid:是存在于细菌 染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。卫星DNA：是出现在非编码区的串联重复序列。其特点是具有固定的重复单位，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。串联重复序列是形成

10、卫星DNA的基础。分类：大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。回文结构：在DNA链上，两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔序列。RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。由于碱基组成的变化而改变了限制性内切酶的酶切位点，从而导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。多基因家族multigene family：核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的基因，其编码产物常具有相似的功能。假基因pseudogene与某些有功能的基因结构相似，但不能表达基因产物的基因。引起DNA损伤的因素及机制：1、紫外线引起DNA损伤：形成胸腺嘧啶

11、二聚体引起DNA之间的交联、DNA与蛋白质的交联、甚至DNA链的断裂。2、电力辐射引起DNA损伤：可导致碱基变化：由.OH自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等可导致脱氧核糖的变化：脱氧核糖分解，最后可引起DNA链断裂。可导致DNA断裂：使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开。引起DNA链交联：包括DNA-DNA链间链内交联和DNA-蛋白质交联。3、烷化剂引起(ynq)DNA损伤：烷化剂导致(dozh)碱基烷基化烷化剂导致(dozh)碱基脱落烷化剂导致DNA断链烷化剂导致DNA链交联4、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变5、其他因素：丫啶类化合物引起碱基插入和碱

12、基缺失；氧自由基。6、DNA也会产生自发性损伤：DNA复制时产生碱基错配；DNA修复使产生碱基错配；碱基自发改变导致DNA损伤：互变异构位导致DNA突变；脱氨基作用导致DNA突变；碱基丢失导致DNA突变。DNA损伤（突变）可分为：链内共价交联、链间共价交联、DNA链断裂、碱基突变（转换和颠换）、插入或缺失、DNA重组等。DNA损伤修复机制：1、某些DNA损伤可以直接修复：DNA断裂口可以直接修复；二聚体可被光复活酶直接修复；烷基化碱基可以直接修复。2、切除修复是细胞内最普遍的修复方式：过程 = 1 * GB3 识别：DNA特异内切酶或糖苷酶识别DNA损伤位点； = 2 * GB3 切除：在损伤

13、位点的5上游切断DNA链，沿5-3方向逐步切除DNA损伤部分合成：DNA聚合酶在缺口处催化DNA合成并沿5-3方向延伸连接：在DNA连接酶的作用下，新合成的DNA片段与原来的DNA链连接。切除修复可分为单个核苷酸切除修复和核苷酸片段切除修复。3、重组修复是DNA损伤较多时的修复方式4、SOS修复是DNA损伤严重时的应急性修复方式。5、细胞周期检查点控制是真核生物诱导修复的主要机制基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。因子依赖性和非依赖性两种机制介导转录的终止：1、不依赖因子的终止子有两个重

14、要特征：一个反向重复序列，使RNA末端形成一个发夹结构在信息链上有一连串的T，因而RNA末端发夹结构之后紧接着出现一串U，RNA/DNA杂交分子的rU-dA碱基对结合力较弱，当发夹结构形成时，RNA聚合酶停止移动，RNA链从DNA上脱落。2、有一些基因的RNA转录终止阶段依赖因子。当RNA聚合酶移动至终止子部位时，因子与其结合，并发挥ATP酶和解链酶活性，使RNA与DNA分离，转录过程终止。原核生物的tRNA转录后的加工：1、剪切作用将多顺反子初级转录产物分离并切除多余序列；2、有些tRNA分子在3端需要修复或添加CCA序列；3、通过某些碱基的化学修饰在tRNA分子中形成希有碱基。蛋白质编码区

15、（开放阅读框ORF）:在mRNA的核苷酸序列中，有一段序列是一个特定蛋白质多肽链的序列信息，这一段核苷酸序列从起始密码子开始、倒终止密码子结束，称为蛋白质编码区或开放阅读框，此段核苷酸序列决定蛋白质的一级结构。SD序列：mRNA起始密码子AUG上游813个碱基处存在的一段特定的核苷酸序列，该序列称为SD序列，是mRNA的起始密码子之所以能与小亚基定位结合的关键。SD序列与小亚基中16SrRNA3端的序列互补，当mRNA与小亚基结合时，SD序列与16SrRNA3端的互补序列配对结合，使起始密码子定位于翻译起始部位。真核生物mRNA的加工：1、甲基化鸟苷酸以5端磷酸基团连接mRNA5端形成帽子结构

16、。2、多聚腺苷酸的加入形成mRNA的3尾。3、mRNA前体经剪接过程除去内含子序列。4、mRNA分子中的少数碱基可被甲基化。5、RNA编辑：是通过对mRNA的加工使遗传信息在mRNA水平上发生改变。时间特异性：在多细胞生物从受精卵到组织、器官形成的各个不同发育阶段，相应基因严格按照一定时间顺序开启或关闭，这就是基因表达的时间特异性。空间特异性：在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现。分子(fnz)伴侣（伴侣蛋白）：是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白，他们在细胞内能协助其他多肽结构完成正确的折叠、组装(z zhun)、转运和降解。管家基因：在生物体生命的全过程都是

17、必须的，且在一个生物个体的几乎所有细胞(xbo)中持续表达的基因。原核生物转录水平调控：原核生物基因多以操纵子的形式存在。操纵子由调控区与信息区组成，上游是调控区，包括启动子与操纵元件两部分。启动子是同RNA聚合酶结合并启动转录的特异性DNA序列，操纵元件是特异的阻遏物结合区。1、启动子决定转录方向、模板链、转录效率。2、不同的因子可以竞争结合RNA聚合酶，打开特定的一套基因。3、阻遏蛋白在转录水平对基因表达具有负调控作用。4、正调控蛋白结合于特异DNA序列后促进基因的转录。5、到位蛋白通过DNA重组倒位而调节基因表达、6、RNA聚合酶抑制物可与RNA结合并抑制转录。7、衰减子可以在转录过程中

18、控制转录水平。严谨反应：细菌在缺乏氨基酸的环境中，RNA聚合酶活性降低，RNA合成减少或停止。衰减子attenuator：细菌中的mRNA转录和蛋白质翻译合成是偶联在一起的。这一特点使细菌的一些操纵子中的特殊序列可以在转录过程中控制转录水平。这些特殊结构称为衰减子。衰减子又称为弱化子，位于一些操纵子中第一个结构基因之前，是一段能减弱转录作用的顺序。乳糖操纵子的作用机制1、乳糖操纵子（lac operon）的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵元件O，一个启动子P和一个调节基因I（是调节基因，编码产生阻遏蛋白）。2、阻遏

19、蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，抑制RNA聚合酶与启动子结合，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。3、CAP的正性调节：lac启动子是弱启动子，在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于

20、操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。CAP：是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他能源。CAP结合DNA是由cAMP控制的。cAMP结合于CAP，诱导CAP发生构象改变，使之能够结合于特定的DNA序列，激活临近基因的转录。cAMP水平降低时，cAMP与CAP解离，CAP转回到无活性的构象，并与DNA解离，这将关闭葡萄糖以外的其他的与糖代谢相关的操纵子。由于CAP的作用依赖于cAMP

21、，因此，CAP又称为cAMP受体蛋白。原核生物翻译水平的调控：一、SD序列是影响翻译的重要因素：1、SD序列的顺序及位置影响翻译起始效率。2、mRNA二级结构可以屏蔽SD序列。二、mRNA的稳定性（降解速度）是翻译调控的另一重要机制。mRNA的5端与核糖体结合，可明显提高其稳定性。三、翻译产物也可以对相应的mRNA的翻译进行调控：1、核糖体蛋白控制其mRNA的翻译。2、翻译终止因子RF2调节自身的翻译。四、小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻译。基因重排：指某些基因片段改变原来存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，再重排成为一个完整的转录单位。真核生物在转录水平(shupng)的调控：主要

22、是通过(tnggu)反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录(zhun l)起始复合物的形成过程。一、转录起始复合物的形成是转录的可调控环节：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。转录起始复合物的形成过程为：TFD结合TATA盒；RNA聚合酶识别并结合TFD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物，开放转录。二、反式作用因子是真核细胞内重要的基因表达调控蛋白

23、。反式作用因子（trans-acting factor）：真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。在结构上含有与DNA结合的结构域。在转录调控过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。反式作用因子三个基本特征一般具有三个功能域：DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域；能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；对基因的表达有正性或负性调控作用，激活和阻遏基因的表达。反式作用因子结构域具有多种结构模式：1、DNA结合域有不同的结构模式：锌指

24、结构借助半胱氨酸和组氨酸与锌离子结合；同源结构域具有螺旋回折螺旋结构：许多反式作用因子结合DNA的结构域中具有一段相同的保守序列，是60个左右氨基酸组成的螺旋回折螺旋结构的区域，称为同源结构域（homeodomain,HD）,简称同源域。亮氨酸拉链结构使两个单体结合并形成DNA结合域。螺旋-环螺旋结构易于形成二聚体碱性-螺旋含较多的碱性氨基酸。2、转录活化结构域是反式作用因子的转录激活区。其模型有：酸性-螺旋结构。带有负电荷的-螺旋区。富含谷氨酰胺结构域存在于多种转录因子中。富含脯氨酸结构域 常与DNA结合结构域相连。三、转录起始是由多种激活的反式作用因子进行复合调控反式作用因子的活性调节：表

25、达式调节反式作用因子合成出来就具有活性；共价修饰磷酸化和去磷酸化，糖基化；配体结合许多激素受体是反式作用因子；蛋白质与蛋白质相互作用蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。反式作用因子的作用方式成环、扭曲、滑动、Oozing。反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。真核生物转录后水平的调控机制mRNA的加工和运输可形成转录后水平的调控：5端加帽

26、和3端多聚腺苷酸化的调控意义：5端加帽和3端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用mRNA运输的控制调节进入细胞质的mRNA量。MRNA的转录、翻译和降解偶联进行 在细菌中，转录和翻译在细胞内的同一部位进行，这两过程是紧密联系、同时进行的。RNA聚合酶结合到DNA上开始转录，并沿着DNA移动，合成RNA，一旦转录开始，核糖体就会结合到MRNA的5端并开始翻译。大部分细菌mRNA都非常不稳定，开始转录后很快就开始降解，mRNA的稳定性对其编码的蛋白质的产量有很大的影响。磷酸化-去磷酸化决定(judng)蛋白质的

27、活性状态 磷酸化修饰是蛋白质共价(n ji)修饰的一种重要方式，包括磷酸化和去磷酸化两种反应。这种修饰决定特定蛋白质的活性状态。蛋白质的磷酸化和去磷酸化分别由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成。蛋白激酶具有转磷酸基的功能，它能将ATP分子中的-磷酸基团转移至蛋白质分子中，使ATP转变成ADP，蛋白质则被磷酸化。磷蛋白磷酸酶是一种去磷酸酶，它能将磷酸化蛋白的磷酸基水解下来(xi li)，使蛋白质转变为去磷酸化状态。第九章 细胞信号传导信息分子：携带生物信息，在细胞之间进行传递的小分子化学物质受体：靶细胞中能够被体内一些生物活性物质如激素、细胞因子所识别，并与之结合将信号传至细胞内产生生物效应的物质，也

28、即细胞接受细胞外信号的接收装置，直接参与细胞的信息传递。受体的化学性质主要为蛋白质。受体的作用：1、识别外源性信息分子，与受体相对应，信息分子亦可以称为配体；2、将配体的信号进行转换，使之称为细胞内分子可以识别的信号，并传递到其他分子，引起细胞的应答。受体与信息分子的结合特点：高度亲和力、高度特异性、可逆行、可饱和性、放大效应。受体的分类：1、细胞表面受体：水溶性、表面信号分子：离子通道受体、G蛋白偶联受体、单次跨膜受体。2、细胞内受体：脂溶性化学信号。可以位于细胞质也可以位于细胞核内。蛋白激酶（protein kinase）：能够将-磷酸基团从磷酸供体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大

29、类酶。蛋白磷酸酶（protein phosphatase）是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化与去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。对蛋白激酶所引起的变化产生衰减信号接头蛋白也称调控结合元件(modular binding domain) 即信号分子中存在着的一些特殊的结构域，大约50-100个氨基酸构成，信号分子通过这些特殊结构域相互识别和作用而有序衔接，形成不同的信号传递链。SH2结构域 信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子SH3结构域 信号分子与含脯氨酸蛋白分子PH结构域 磷脂分子PIP2、PIP3PTB结构域 同SH2 ：信号

30、分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子G蛋白的循环和活化：一、G蛋白的组成 三聚体G蛋白由、三种亚基组成。亚基具有GTP水解酶活性，又有调节效应蛋白作用，和亚基具有调节亚基作用，也有调节效应蛋白的作用，而且亚基上有脂链，故具有固定作用。这三个亚基可以聚合在一起形成三聚体，也可以解离为和形式。当G蛋白与GDP相结合时无活性，而与GTP结合时则活化成激活状态。 二、G蛋白循环受体与信息分子结合后，受体构象改变，并使与受体相偶联的G蛋白构象改变，使GTP置换了GDP。G蛋白激活后，离开受体并解离成和亚基GTP，亚基水解GTP，并调节腺苷酸环化酶的活性，调节细胞内cAMP等第二信使的浓度，从而把信息传导给下游分子

31、，同时，与亚基结合的GTP水解成GDP，然后亚基GDP复合物重新与亚基结合形成无活性的三聚体，完成一次信息传导。G蛋白这种有活性和无活性状态的转换称为G蛋白循环与转录因子偶联的受体： 多位于胞内，与一些疏水性信息分子相识别，如类固醇激素、甲状腺素、前列腺素、维生素A等。这种受体主要包括三个区域，羧基端为激素等信息分子的结合区域，氨基端为转录活化区，调控某些基因的启动子或上游的调控基因，中央部分为DNA的结合区，富含碱性氨基酸，平时此区与抑制蛋白结合形成复合物。受体与信息分子结合时，发生构象变化，抑制蛋白脱落，暴露出DNA的结合区，转入胞核内，与特定DNA部位结合，调控转录活性。cAMPPKA

32、途径(tjng)-活化(huhu)：信号分子与受体结合(jih)，引起受体构象变化受体活化G蛋白（结合GTP，与解离）活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶（AC）AC催化ATP生成cAMPcAMP活化PKA（依赖cAMP的蛋白激酶）PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达cAMPPKA途径-失活：信息分子与受体解离，受体失活G蛋白失活（GTP被水解成GDP，亚基重新聚合）AC失活cAMP被磷酸二酯酶水解PKA失活胰岛素受体介导的信号传导通路（一）胰岛素受体介导的IRS-1-Ras-MAPK信号通路：这一通路主要涉及胰岛素受体的基因表达调控的信号传导。步骤：1、受体二聚体的形成及其磷酸

33、化。2、募集接头蛋白Grb2。3、Grb2的SH3募集SOS.4、Ras的活化。5、MAPK的级联激活。6、转录因子的磷酸化及其转录调控作用。（二）胰岛素受体介导的IRS-PI3K-PKB信号通路：此通路与胰岛素对代谢的调节密切相关，与细胞存活密切相关。步骤：1、PI3K的p85亚单位通过SH2结构域与发生了洛氨酸磷酸化的IRS-1结合，p110催化亚单位激活。2、活化的PI3K催化PIP2磷酸化（D-3）生成PIP3。3、PIP3与PKB的PH（pleckstrin-homology domain）功能区结合，PKB构象变化并转位到胞膜，同时PIP3依赖的蛋白激酶（PDK）也与PIP3结合，

34、使二者相互靠近。4、PDK催化PKB发生磷酸化，激活PKB。5、PKB可磷酸化多种蛋白，介导代谢调节、细胞存活等效应。细胞通讯方式 1)细胞间隙连接通讯 两个相邻的细胞间通过管道状的亲水性孔道自由交换分子质量1500以下的水溶性分子2)膜表面分子接触通讯 每个细胞都有众多的蛋白质或糖蛋白、蛋白聚糖分子分布于质膜的外表面。这些表面分子作为细胞的触角，可以与相邻细胞的膜表面分子特异性相互识别和相互作用，以达到功能上相互协调，即为膜表面分子接触通讯。3）化学信号介导的通讯 多细胞生物与邻近细胞或相对较远距离的细胞之间的信息交流主要是由细胞所分泌的化学物质，如蛋白质或小分子有机化合物所完成的。这些分子

35、称为化学信号。它们作用于周围或距离较远的期货种类细胞，调节其功能，这种通讯方式称为化学通讯。第十章 细胞增生和凋亡的分子机制细胞周期中的四个checkpoint:（1）G1晚期 限制点 监控G1期细胞大小及环境中是否有生长因子（2）G1S 转折 监控DNA是否损伤（3）G2 M 转折 监控DNA是否损伤、DNA是否已正确完整地复制。（4）有丝分裂中期关卡 监控姐妹染色单体是否已稳定的附着在纺锤体上。参与细胞周期调控的蛋白质1、周期蛋白（cyclin) 2、周期蛋白依赖性激酶（Cdk）3、周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）4、Rb蛋白及E2F-DP1转录因子5、调节CdK磷酸化和去磷

36、酸化的蛋白激酶和磷酸酶6、泛素（ubiquitin）和使蛋白泛素化的酶（一）cyclin和Cdk复合物驱动细胞周期进程 周期蛋白B和Cdk1的复合物又称成熟促进因子。 Cdk 是种蛋白激酶，单独存在的Cdk无活性，与相应的cyclin结合后变构而激活，并受磷酸化和去磷酸化的调控在有无活性间转换，有活性的Cdk 复合物能够磷酸化底物蛋白，调控它们的活性，驱动细胞周期，而 Cdk 复合物的活性又受CKI的抑制。（二）CKI抑制Cdk1及周期蛋白-Cdk复合物的活性CKI分类：Ink 4 家族：p15,p16,p18,p19蛋白。主要抑制Cdk4或Cdk6，抑制cyclin D与Cdk4或Cdk6结

37、合，也抑制其复合物利用ATP磷酸化底物的功能。Cip/Kip 家族： p21,p27,p57蛋白。是细胞接受到接触抑制、DNA损伤、低氧或某些细胞因子信号后的产物，主要功能是与cyclin Cdk复合物结合，抑制它们的活性。（三）Rb蛋白与E2F-DP1结合，使E2F-DP1不能引起基因的转录，起负调控的作用。（四）使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk活性（五）泛素-蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用。周期(zhuq)蛋白：是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积(lij)与分解的蛋白质，它与周期素依赖性激酶共同影响细胞周期的运行。调控蛋白的协同(xitng)作用（一）Cdk4/

38、6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素分别与cyclin D、E先后结合，导致RB磷酸化释放E2F-DP1，靶基因转录，细胞由G1S，然后cyclin D、E经SCF复合物多泛素化而降解。（二）Cdk1的活化是G2M关卡处关键调控因素cyclin B与Cdk1结合，导致底物蛋白的磷酸化，G2 M。（三）APC介导多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素 cyclin A/B Cdk1 APC磷酸化连接姐妹染色体蛋白降解， M G1。（四）DNA损伤关卡致G1、G2期停滞 1 、通过系列磷酸化导致G2停滞 DNA损伤 活化ATM和ATR 磷酸化Chk2和Chk1cdc25C 与

39、14-3-3结合cdc25C无法活化Cdk1 G2停滞DNA修复。 2、P53致G1、G2停滞 细胞凋亡（apoptosis)：是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序性死亡过程，它的发生受机体的严密调控。细胞凋亡的形态特点：染色体固缩、膜起泡、核膜消失、DNA断裂凋亡小体形成。主要的细胞凋亡信号转导途径（一）外源性死亡受体途径的关键步骤是死亡诱导信号复合物的形成 有8种受体，都属于TNF家族成员。 Fas结合Fas LFas 三聚体，激活死亡结构域募集FADD分子 Fas-FasL-FADD 死亡诱导信号复合物（DISC），并激活死亡效应域caspase 8自我激活激活caspa

40、se 3 细胞凋亡。（二）内源性线粒体途径的关键步骤是细胞色素C从线粒体膜间隙释放到细胞浆 进入胞浆的细胞色素C与Apaf 1、ATP/dATP结合形成凋亡体（apoptosome） Apaf 1通过胱天蛋白酶募集域（CARD）与caspase 9前体的CARD相互作用而募集caspase 9前体 caspase 9自我激活激活caspase 3 细胞凋亡。（三）正、负调节和两条凋亡途径的串话第十七章 细胞增生和凋亡相关基因与疾病原癌基因（proto-oncogene)是一类广泛存在生物体中，高度保守的基因，其产物具有调控细胞增生的重要功能，当其受某些因素的影响，能发生突变（活化）成为癌基因，

41、导致细胞恶性转化。原癌基因的特点：1、广泛存在于生物体；2、高度保守，功能相似；3、产物有重要功能；4、某些因素作用下，可发生突变，使细胞恶性转化。原癌基因的产物：是信号转导途径及基因转录的关键分子。生长因子、生长因子受体、非受体洛氨酸蛋白激酶、G蛋白。原癌基因的活化(huhu)机制：1、点突变(tbin)2、基因(jyn)扩增3、基因重排4、染色体易位5、插入诱变癌基因的功能： 1、转化（transformation)细胞形态发生变化，持续增生。调控转化的原癌基因产物主要是位于细胞及胞浆。2、永生化（immortalization) 细胞分化受阻，不衰老死亡。调控永生化的原癌基因产物主要是位

42、于细胞核内的转录因子。抑癌基因（tumor suppressor gene）：指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。抑癌基因的作用：1、RB和P53调节细胞周期关卡 1）低磷酸化的RB蛋白能阻止细胞从G1期进入S期2）正常细胞受持续的细胞分裂因素刺激后p16基因表达，p16蛋白抑制Ddk4/6 3）p16基因座位中还有p14ARF基因，它与p16基因部分重叠，能与p16基因一起表达4）DNA损伤也能活化p53基因表达5）p53能使细胞周期停滞及诱导细胞凋亡，此外还可活化p21基因表达，起抑制周期蛋

43、白-Cdk复合物的作用2、调节信号转导抑制细胞增生3、促进DNA修复维持基因组稳定第十一章 基因分析的基本策略Sanger双脱氧链末端终止法原理： 在DNA聚合酶催化下，以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新链DNA的合成。DNA链中核苷酸以3,5-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是 2-脱氧核苷三磷酸。2,3ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳就可以分辨出具有特定末端不同长度的DN

44、A片段。Maxam-Gilbert化学裂解法原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经电泳分离得出待测DNA片段的核苷酸序列。基因拷贝数的分析Southern Blot原理：根据基因序列合成探针，利用同源互补序列可以退火形成异源双链的原理，探测检测对象中能与探针结合的DNA序列。Southern blot的基本步骤：DNA的酶切消化和基因探针的标记；酶切消化：要保证基因的完整性。 探针标记：探针序列的确定和检测信号的选择。Northern blot定性分析mRNA。 技术的关键是在于 RNA的制备和（变性）电泳。PCR

45、技术的基本原理：作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在TaqDNA聚合酶作用下引导新链DNA的合成，经过25-30个变性、退火和延伸的循环，获得特异性的DNA片段扩增产物。RT-PCR技术：以RNA为模板体外扩增cDNA 的技术，可用于定性和相对定量（半定量）。 基本步骤：提取总RNA，然后将其中的mRNA在体外逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因的PCR扩增。转录后RNA剪接的分析RNA酶保护试验（RPA）：是一种液相杂交技术，通过RNase A 和RNase T1专一性降解单链RNA，分析受到保护的杂交双链RNA，以确定RNA的剪接情

46、况、剪接位点以及基因内含子的可能位置等。蛋白质的定性定量分析：指的是对特定基因产物蛋白质的定性和定量及定位分析。一、从总蛋白质中鉴定特定的蛋白质Western blot 技术(jsh)：是一种免疫印迹技术(jsh)，以偶连标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。基本步骤：蛋白质样品的制备和SDS电泳分离，蛋白质转膜，标记的抗体与膜上蛋白质进行抗原抗体的结合，检测(jin c)并分析标记物信号。（在样品中蛋白质表达水平很低时，可通过免疫沉淀收集蛋白质。）二、在细胞水平分析特定蛋白质流式细胞术：用荧光标记的抗体结合细胞表面或内部的特定蛋白质分子（抗原），经过流式细胞仪分析荧光

47、信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的情况对基因的表达活性作出判断。三、细胞定位分析特定的蛋白质免疫组织化学（或免疫细胞化学）技术基本步骤：抗体的制备与标记，标本（组织或细胞）的制备，组化染色和结果的观察。第十二章 基因功能分析的基本策略特定基因功能研究的基本策略：通过特定基因的导入和特定基因的剔除或表达的抑制，制备模式生物体或体外培养的细胞模型，观察和检测其表型（包括整体、细胞、分子水平）的变化，从而分析、鉴定特定基因的功能。转基因模型包括转基因动物模型和转基因的细胞模型。转基因动物（transgenic animal）:应用转基因技术培育的携带外源基因并能稳定遗传的动物。转基因技术 是指将外源

48、基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA间随机重组的发生而将外源基因插入到受体染色体DNA中，并随着细胞的分裂而遗传给后代，以这种方式可以制造转基因动物模型。转基因动物的制备基本步骤：将目的基因（或基因组片段）导入实验动物的受精卵（或着床前胚胎细胞），然后将其植入受体动物的输卵管或子宫中，发育成携带有外源基因的个体，并通过分析其基因组中外源基因的整合状况及其揭示外源基因功能的表型，在此基础上经过常规的遗传育种方法培育出转基因动物。转基因动物的应用：1、确定特定基因的功能 2、发现新基因功能 3、发现新基因（突变） 4、研究基因表达的时空性 5、建立动物模型 6、产生需要

49、的器官或组织基因敲除（gene knockout）：指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因，从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程1打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。2 胚胎干细胞的体外培养3打靶载体导入胚胎干细胞4同源重组胚胎干细胞的筛选5基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡6胚泡植入假孕小鼠的子宫中7杂交育种获得纯合的基因敲除动物基因敲除动物（gene knockout animal）：采用同源重组定向剔除特定基因的技术，所制备的某特定基因丧失功能的动物。基因敲除小鼠：应用基因敲除技术，使两条染色体上特定等位基因都丧失功能的小鼠。基因

50、表达的抑制或沉默是通过在RNA水平的干涉来分析特定基因功能的方法。（1）反义RNA封闭目标RNA的功能 （2）RNA干涉（RNA interference, RNAi） 使特定基因沉默。反义RNA（antisence RNA)：能与mRNA互补配对的RNA分子。两种方法：1、人工合成反义RNA导入细胞抑制mRNA 2、构建载体导入细胞转录反义RNA 抑制mRNARNA干涉是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因表达受到抑制。原理：双链RNA 激活Dicer（ 酶复合物，由核酸内切酶和解旋酶组成），识别异常的双链RNA并将其切割成短双链RNA（siRNA，21-23bp）， si

51、RNA与Dicer结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），双链RNA经解旋酶作用，成为单链RNA，识别并结合靶RNA分子，致核酸内切酶的切割，失去编码蛋白质的功能。两个步骤：1、长双链RNA成为小干涉性RNA （SiRNA); 2、RISC形成，识别SiRNA同源的mRNA ，并切割。选择(xunz)目标RNA干涉(gnsh)靶点的注意点：1、避开蛋白(dnbi)结合部位，选择AUG下游50-100bp区的AA（N19）TT或AA（N21）序列；2、GC比50%左右，长30nt；3、与其它RNA序列无同源性。主要步骤：1、确定目标RNA并选择被干涉靶点；2、准备针对目标RNA的siRNA；3

52、、用siRNA干涉目标RNA;4、目标RNA含量和蛋白质水平的分析。不同的基因突变类型引起不同的遗传效应 1。基因突变引起遗传密码的改变 1）错义突变是能导致蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生改变的基因突变2）无义突变是能导致蛋白翻译提前终止的基因突变3）同义突变是不引起蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生任何改变的基因突变4）移码突变是使阅读框移动的基因突变2。基因突变影响hnRNA的剪接 如果基因变导师发生在特定剪接位点上，就会影响hnRNA的剪接，导致剪接错误，产生异常的mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变相应的生物学形状。基因突变 在基因的特定DNA序列中，其碱基组成及排列顺序可因机体内外

53、因素的作用发生改变，导致DNA一级结构发生改变，改变基因结构，形成基因突变。基因突变的类型 1。点突变是单个碱基的突变2。缺失是一个或多个核苷酸的丢失3。插入是一个或多个核苷酸的增加4。倒位是一段核苷酸序列方向倒转5基因突变还可分为配子突变与体细胞突变6。动态突变指重复拷贝数随世代的传递而改变第十三章 基因工程DNA 重组（DNA recombination）：不同来源的DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术。分子克隆：在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入宿主，使其在宿主中扩

54、增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。基因工程(genetic engineering)：有目的地通过分子克隆技术，利用克隆基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。基因工程的研究内容：1.目的基因的获取：从生物有机体的基因组中分离带有目的基因的DNA片段；2.重组：在体外将带有目的基因的DNA片段连接到能自我复制并具有选择标志的载体分子上，形成重组分子；3.将重组分子导入受体细胞（细菌）:K-12。4.带有重组子的细菌扩增，获得大量的繁殖群体。5.筛选：从大量的细胞繁殖群体中筛选出带有重组DNA分子的克隆。6.分析和表达：将选出的细胞克隆的

55、目的基因进行进一步分析并实现功能蛋白的表达分子克隆常用的工具酶：一、限制性核酸内切酶（RE）：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。分类：可分为、型三大类。型酶作用特点：只有限制性活性，无甲基化活性；只需Mg+作为催化反应辅助因子，无须。识别顺序一般为46个碱基，通常是回文结构（反转重复顺序），即具有180的旋转对称。二、DNA连接酶（DNA Ligase）：T4 DNA Ligase。催化两个独立双链DNA片段5-磷酸基和3-羟基之间形成磷酸二酯键；修复双链DNA中一条链上的缺口。三、DNA聚合酶（DNA Polymerase）1、DNA polymeras

56、e I （全酶，Kornberg polymerase）具有至少3种活性： 53聚合酶活性；5 3外切酶活性；3 5外切酶活性。应用：1、催化DNA缺口平移（nick translation）反应，制备高比活DNA探针；2. 第二cDNA链合成3. 对双链DNA3突出末端进行末端标记；4. Sanger 测序 2、大肠杆菌DNA聚合酶klenow片段：53聚合酶；3 5外切酶；缺失53外切酶活性 应用：全酶第2-4。四、逆转录酶 （reverse transcriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称cDNA（complementary

57、DNA）。用于mRNA为模板合成cDNA，是构建cDNA文库和RT-PCR技术中的关键工具酶。五、末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）:将dNTP加到DNA3羟基。作用：3端标记DNA探针在载体和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重组。六、碱性磷酸酶（AP）： 催化去除DNA、RNA、NTP及dNTP的5磷酸基团。1. 在用32P标记5末端前，去除DNA或RNA的5磷酸基；2. 在连接反应中，去除载体DNA片段5磷酸基，防止自身环化。载体(zit)(Vector)能在连接酶作用(zuyng)下和外源DNA片段连接(linji)并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子DNA聚合酶1的应用 1.催化

58、DNA缺口平移（nick translation）反应2.对双链DNA3突出末端进行末端标记3.第二cDNA链合成：类似“缺口平移”4. Sanger 测序基因克隆主要步骤 1)制备目的基因和相关载体2)将目的基因和有关载体进行连接3)将重组的DNA导入受体细胞4)DNA重组体的筛选和鉴定5)DNA重组的扩增、表达和其它研究良好的载体应具备以下条件：1. 必须有自身的复制子；2. 载体分子上必须有限制性内切酶酶切位点,即多克隆位点（multicloning site,MCS），以供外源DNA插入3. 载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子； 4. 载体分子必须具有足够的容量

59、5. 可通过特定的方法导入宿主(氯化钙，磷酸钙，电击，等)。6. 对于表达载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导顺序，增强子，加尾信号等调控DNA元件。一、质粒载体：小片段DNA克隆，测序。特点1、分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。2、具有一个以上的遗传标记，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因、-半乳糖苷酶基因（lac Z）等。3、具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这个位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。二、噬菌体载体：构建基因文库（shotgun 基因组文库、cDNA文库）及 表达文库。DNA可以作为载体，通过替换

60、自身序列的方式携带外源DNA，这种载体称为替换型载体三、粘性质粒适合克隆较大的DNA片段：由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建而成。粘粒载体大小为4-6kb，插入片段则可大至29-50kb应用于大分子量DNA克隆。特点：含有质粒的抗药性标记如Ampr基因。带有噬菌体的粘性末端（cos区）具有一个或多个限制性内切酶的酶切位点。粘性质粒本身不大非重组体粘粒很小，不能在体外包装，因而重组体的本底很低，有利于筛选。四、M13 噬菌体载体：制备单链DNA, 人工诱变五、病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞六、BAC ：大片段DNA 克隆，0.1-0.4 MB。构建物理图谱基因工程的操作程序（大题）：一、