课题申请报告-力学刺激对植体-骨界面骨系细胞mRNA表达的影响

1、力学刺激对植体-骨界面骨系细胞mRNA表达的影响Effects of the mRNA expression in implant-bone interface bone cells after mechanical stimulate摘要在建立力学刺激骨系细胞的动物实验模型的基础上，利用激光捕获显微分离技术（LCM）, 获取动物模型体内种植体骨界面区域的成骨细胞和破骨细胞,用基因芯片法检测不同力值的间断力学刺激作用下基因表达谱的时序变化。明确从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中，基因表达的差异和相关的特异性基因，探讨成骨细胞和破骨细胞的耦联机制，从系统角度研究生理负荷促进骨形成和超负荷导致骨破

2、坏的基因调控机制的差异，尝试筛选出与骨形成和骨破坏相关基因，以为骨生物力学及骨组织工程学提供理论依据，并进一步完善负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建机制的理论，为临床诊断和防治提供理论先导。（一）立项依据与研究内容1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。随着医学科学的发展，一些人工种植体或装置越来越多的被植入骨组织，用于治疗病变和修复缺损，如人工关节、牙种植体，以及骨内固定装置等。理想的人工种植体或装置应以与骨组织紧密结合(骨整合Osseointegration)的形式行使其生理功能, 然而，仍有部分植入体不能达到或保持长期的骨整合，导致植入体松动、脱落和并发症的产生，除了植入体材料本身

3、的因素之外，负荷后骨组织的应力变化也是重要的影响因素之一，且已引起众多学者的关注。由于植入体与骨组织之间始终存在一个界面，负载后界面骨组织的应力应变与正常骨组织负载后的应力应变不同，这种力学环境的改变，可能会促进骨组织与人工材料的界面发生适应性改建，达到理想的骨整合；也可能会导致骨组织与人工材料的界面发生骨吸收。骨吸收会使种植体与骨组织分离，增加了植入物微粒、细菌及炎症介质等侵入的机会，引起炎症反应，加速骨吸收并造成植入体松动，进而影响种植体的生存率和生存时间。因此，了解力学刺激对骨组织与人工材料界面骨改建的影响，将有助于解释临床观察到的现象，有助于与骨生物力学相关的诸学科的发展，如骨折固定、

4、人工关节置换、牵张成骨、口腔种植修复、口腔正畸、骨质疏松症的防治及骨组织工程研究等等。机械刺激产生的耦合力传递到骨组织，使骨系细胞发生应力应变作用，这些变化通过多个信号转导通路的转导，导致骨系细胞产生多种生物学效应并完成骨的改建。成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC)是骨改建的两大主要功能细胞，在应力、生长因子、激素等作用下两者之间相互作用，相互调控，使骨产生适应性地构建。其中由应力应变造成细胞的生物学反应和变化，引起了人们的关注1，多数学者认为2：不同的力学刺激可以导致成骨细胞、破骨细胞活性和数量的变化，影响骨形成与骨吸收，而这显然是由于骨系细胞基因表达和基因调控发生变化的结果。目前的研究证据表

5、明：1、体外培养成骨细胞加载研究证明3-5：成骨细胞未受力时, 早期即刻基因c-fos、c-jun在细胞静止期内不表达；受力学刺激后初期即明显增加，其表达一般与细胞的增殖分化同时出现，因而其转录翻译蛋白可能对其它晚应答的基因转录起调控作用。Ikegame等6发现：加载6h后，骨形成蛋白-4（BMP-4）基因表达增加，成骨特异性转录因子cbfa1/Osf-2也随着BMP-4基因表达开始表达。Pavlin等7发现：加载24h后，成骨细胞中骨钙蛋白水平轻度下降，但在加载1-2d，其表达增长了4.6倍，到第4d则增长了7倍，达到其增长的最高峰；I型胶原基因的表达在加载后第1d不明显，但在第2d其表达增

6、长了3倍，并在其后6d维持这一水平。Cillo等8则针对另外一些重要的基因表达进行了研究：实验中发现拉伸应力可以使TGF-和胰岛素样生长因子-II的mRNA表达增加，碱性成纤维细胞生长因子表达减少，且不同的力值和加载时间对这些基因的表达有不同的影响。显然成骨细胞受力后，基因的表达在一定的时间范围内存在明显的时序性变化。2、破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞，传统认为破骨细胞是一个“惰性细胞”，对力学刺激不敏感，主要是通过成骨细胞感受力学刺激以后，通过耦联机制影响破骨细胞的活性、增殖和迁移。但是最近的研究表明9：应力可直接导致体外培养的破骨细胞mRNA表达的增强，并伴随着骨吸收能力的增强。3、多数实

7、验是建立在对OB、OC静态加载的基础上，但动态载荷对骨改建的影响远大于静态载荷，已得到很多学者证实，即间歇性的周期性力学刺激对细胞的增殖分化功能和基因表达的作用明显大于持续性静态负荷的作用10-11。但其原因和机理尚不清楚。4、对力学信号转导的研究表明12-14：骨系细胞表面的离子通道在细胞膜受到力学作用数秒或数分钟后即可引起G蛋白活化、第二信使释放、蛋白质磷酸化、生长因子的分泌、细胞骨架的变化、细胞和细胞外基质粘附的重建，最终导致基因表达的变化。基因表达的变化可能反过来影响信号的转导 13。成骨细胞在某些力学刺激因素作用下表达一些因子，从而将骨吸收信号传递给破骨细胞的前体细胞，使之分化发育并

8、活化，行使骨吸收功能。骨保护素（OPG）和骨保护素配体（OPGL）的发现证实了这一假说，并提供了分子基础13-14。有研究表明14-15：作为细胞表面重要受体的整合素，通过识别某些胞外基质蛋白，介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质的粘附反应并接受、转导级联信号，并有可能是力学信号传递的通道。从以上研究中可以看出：（1）力学刺激导致OB、OC基因改变的过程涉及众多基因的变化，但针对个别基因的研究显得较为凌乱，基因之间的相互影响也不清楚，不能精确地阐明各基因在这一过程中的作用。（2）多条信号转导通路之间存在着密切的耦联关系，不同的力学信号可能通过这些内在相连的信号通路，以不同的方式影响骨系细胞的反应。

9、这些不同信号通道是如何介导力学刺激，而导致OB、OC基因表达的时空变化？是否存在某些尚不为人所知的信号转导分子？信号通路之间又是如何耦联的？这方面的认识尚不明确，只能从基因表达的变化来找寻方向。（3）由于各学者多采用体外实验，实验条件不尽相同，导致实验结果的可比性较差，有关体内实验的报道，特别是力学刺激对人工种植体-骨界面骨系细胞基因表达影响的报道也极为罕见。因此，有必要同期从体内外观察OB、OC受力后整个基因表达的时序变化，探讨各相关基因在骨形成和骨吸收过程中的确切作用，并探讨其临床应用前景和意义。Vaes16等人曾尝试应用基因芯片的方法，找寻骨形成蛋白-2诱导成骨细胞分化过程中的标记基因，

10、为探寻力学信号对骨系细胞基因表达的影响提供了一个好的思路。基因芯片技术是一项新兴的能检测全范围mRNA表达水平变化的技术，具有高通量、并行化的特点，可为研究基因调控网络及其机理，揭示不同层次多基因相互作用的生理、病理现象提供有效手段17,18。然而，骨组织是不同细胞群体相互作用的三维空间结构，通过磨碎活组织所提取的DNA、RNA不能代表特定生理或病理过程中单一同类细胞的信息。激光捕获显微切割技术19（Laser Capture Microdissection ，LCM）则是解决细胞异质性问题的革命性技术，是在显微镜下从组织切片中分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞的技术。从LCM捕获的同质细胞中

11、提取mRNA可构建cDNA文库，进行cDNA微列阵分析20。因此，我们相信LCM技术与基因芯片的有效结合，将能够清晣地勾画出力学刺激后人工种植体-骨界面OB、OC在生理、病理过程中的基因表达的改变。综上所述，骨作为一个自适应的生物系统是通过多层面、多因素的网络调控来完成应力作用下的骨改建，显然以往只针对其中某一层面、若干因素的单一视角的研究，难以系统透彻地阐述应力作用下骨形成和骨吸收的基因调控机制。因此有必要从整个基因组的水平探讨应力作用下骨系细胞上千个基因的动态表达，既要从分子水平来研究其机理，也要从系统层面动态研究骨系细胞基因的时序变化，把分析和综合统一起来，同时也可以对目前众多单基因水平

12、的研究进行分析、评价和比较，从而明确不同力学刺激导致骨形成和骨吸收的基因调控的异同，试图发现新的重要的调控基因，筛选出能特异性表明骨形成和骨吸收的“标记”基因，不仅为骨生物力学及骨组织工程学提供理论依据，而且对负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建机制的认识、临床诊断和防治等也有重要的意义。参考文献：1、Lee TC, Staines A, Taylor D. Bone adaptation to load: microdamage as a stimulus for bone remodelling. J Anat. 2002 Dec;201(6):437-46.2、Femor B,Cundl

13、e R, Evans M,et al.Primary human osteoblast proliferation and prostagland in E2 release in response to mechanical strain in vitro. Bone ,1998;22(6:)637.4、Peake MA, El Haj AJ.Preliminary characterisation of mechanoresponsive regions of the c-fos promoter in bone cells.FEBS Lett. 2003 Feb 27;537(1-3):

14、117-20. 5、Kletsas,Dimitris,Basdra,et al. Effect of proteinkinase Inhibitor on the stretch-elicited c-fos and c-jun up-regulation In human PDL osteoblast-like cells J.Cell Physiol,2002,190(3):313321.6、Ikegame M,Ishibashi O,YOSHIZAWA T,et al.Tensile stress Induces bone morphogenetic protein 4 in preos

15、teoblastic and fibroblastic cells,which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culrure JBone Miner Res,2001,16(1):24-32.7、Pavlin D, Zadro R, Gluhak-Heinrich J. Temporal pattern of stimulation of osteoblast-associated genes during mechanically-ind

16、uced osteogenesis in vivo: early responses of osteocalcin and type I collagen. Connect Tissue Res. 2001 Oct;42(2):135-48. 8、 Cillo JE,Gassner R,Koepsel RR, et al. Growth factor and cytokine gene expression In mechanically strained human osteoblast-like cells:Implicaltions for distraction osteogenesi

17、s J.Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2000,90(2):147154.9、 Nakamura I, Rodan GA, Duong le T.Regulatory mechanism of osteoclast activation.J Electron Microsc (Tokyo). 2003;52(6):527-33.10、Winter LC, Walboomers XF, Bumgardner JD, Jansen JA.Intermittent versus continuous stretching effects on oste

18、oblast-like cells in vitro. J Biomed Mater Res. 2003 Dec 15; 67A(4): 1269-75.11、Di Palma F, Douet M, Boachon C, et al. Physiological strains induce differentiation in human osteoblasts cultured on orthopaedic biomaterial. Biomaterials. 2003 Aug; 24(18): 3139-51. 12、Rosenberg N.The role of the cytosk

19、eleton in mechanotransduction in human osteoblast-like cells.Hum Exp Toxicol. 2003 May;22(5):271-4. 13、Moalli MR, Caldwell NJ, Patil PV, et al.An in vivo model for investigations of mechanical signal transduction in trabecular bone.J Bone Miner Res. 2000 Jul;15(7):1346-53. 14、 Filippo G,Giancotti an

20、d Erkki Ruoslahti . Science 1999 August 13; 285: 1028-1033. 15、Li L, Chen M, Deng L, Mao Y, et al.The effect of mechanical stimulation on the expression of alpha 2, beta 1, beta 3 integrins and the proliferation, synthetic function in ratosteoblasts.Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2003 Jun;20

21、(2):187-92. 16、Vaes BL, Dechering KJ, Feijen A, et al.Comprehensive microarray analysis of bone morphogenetic protein 2-induced osteoblast differentiation resulting in the identification of novel markers for bone development.J Bone Miner Res. 2002 Dec;17(12):2106-18. 17、Schena M.Shalon D. Davis R W.

22、 Brown P O.Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science,1995,270(20):467-470.18、Qackenbush J. Genomics Microarrays-guilt by association science,2003, 302(5643):249-55.19、Yim SH, Ward JM, Dragan Y, et al.Microarray analysis using amplified mRNA from

23、 laser capture microdissection of microscopic hepatocellular precancerous lesions and frozen hepatocellular carcinomas reveals unique and consistent gene expression profiles.Toxicol Pathol. 2003 May-Jun;31(3):295-303.20、Ying SY, Lin SL.Gene expression in precursor cells of prostate cancer associated

24、 with activin by combination of subtractive hybridization and microarray technologies.Biochem Biophys Res Commun. 2004 Jan 2;313(1):104-9.2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究内容：第一部分：建立将力学刺激传递到骨系细胞的动物实验模型，通过动物实验验证间断力学刺激与骨形成和骨破坏之间的关系，确定本实验中拟采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。第二部分：体外培养OB和OC，采用基因芯片法检测不同力值的间断力学刺激下OB和OC基因表达谱的时

25、序变化。第三部分: 利用激光捕获显微分离技术, 采集动物模型体内种植体骨界面区域的OB和OC,再用基因芯片法检测“生理”负荷和“超”负荷下各类细胞基因表达谱的时序变化。第四部分：采用RT-PCR方法，对骨形成和骨破坏过程中OB、OC基因表达变化差异最大的几个基因进行检测和验证。第五部分：统计学分析比较体内外OB、OC基因表达的时序变化和差异，分析从骨形成到骨破坏过程中整个基因组表达的差异及其作用机制。研究目标：本研究拟通过体内外实验，探讨从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中骨系细胞基因表达的差异，从整体角度分析“生理”负荷促进骨形成和“超”负荷导致骨破坏的基因调控机制，明确相关的特异性基因表达，

26、探讨OB和OC在力学刺激下的耦联机制，探索未知的相关调控基因或信号转导相关基因，从而为与骨生物力学相关的临床学科提供分子水平的理论基础以及临床应用的指导。拟解决的关键问题1）、建立动物模型，确定本实验中拟采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。2）、通过体内体外OB和OC，在间断力学刺激下不同时间点取样的基因表达谱的比较，研究骨系细胞基因表达的时序变化。3）、通过体内体外OB和OC基因表达谱差异的对比分析，探讨OB和OC的耦联机制。4）、通过探索骨形成和骨破坏过程中OB和OC特异性基因表达的种类和丰度，尝试找寻相应的“标记”基因。5）、通过基因表达谱的比较，结合基因数据库的数据，结合重要调控

27、基因的发现，从整体角度分析负荷状态下骨组织与人工材料界面骨改建的机制，为进一步研究提供新的线索和思路。3、拟采取的研究方案及可行性分析。研究方案一）、实验动物模型的建立及间断力学刺激对骨系细胞影响的观察1）、选6月龄SD大鼠60只，雌雄各半，分别单侧股骨植入纯钛种植体（2.0，L 8）骨外暴露4mm，以备加力用，2-3月后，X光验证骨整合者备用。 2）、随机分为5组，Zwick1454自动材料万能试验机分别以0N，5N，10N，20N，40N力值、2HZ的频率给种植体轴向加载，每天3次，每次1小时，连续3周。如种植体明显松动，停止加载，取材检测。3）、3周后取材， 通过骨形态学计量方法分别检测

28、各种植体周围骨质的骨小梁表面成骨细胞数、骨小梁表面破骨细胞数、有成骨细胞被覆的类骨质表面占骨小梁总表面的百分比、骨小梁吸收表面占骨小梁总表面的百分比等相关指标检测。4）、各指标经统计学分析，确定临界负荷及本课题将采用的“生理”负荷和“超”负荷的标准力值。二）、体外培养的成骨细胞、破骨细胞在间断力学刺激下基因表达谱的基因芯片检测1）、体外培养成骨细胞和破骨细胞，观察不同负荷下的生物学性状。（已积累经验）2）、将前期实验测出的标准“生理”负荷和“超”负荷换算成大气压，通过气压加压装置间断加力于体外培养的成骨细胞和破骨细胞，其力学参数参考前期实验。3）、将“生理”负荷和“超”负荷作用于成骨细胞，以1

29、h ,24h ，48 h，4d为取样点，未加力为对照，抽提mRNA后，逆转录标记cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。(取样时间点系根据前期实验总结、临床经验、及参考相关文献提出)4）、将“生理”负荷和“超”负荷作用于破骨细胞，以1h ,24h ，48 h，4d 为取样点，未加力为对照，抽提mRNA后，逆转录标记cDNA ，应用基因芯片技术检测成骨细胞基因表达谱的时序变化。三）、体内骨组织不同负荷和时间下成骨细胞和破骨细胞基因表达谱基因芯片检测1）、90只SD大鼠动物模型，随机分为三组，每组各30只。2）、I组：按“生理”负荷力值加载，随机选5只大鼠，分成6小组，分别在

30、1h加载后，以及24h, 48 h，4d加载（每天3次，每次1小时）后取下大鼠股骨，分别分离种植体和骨组织，取与种植体交界处骨组织，采用激光捕获显微分离技术分别分离出成骨细胞和破骨细胞，将每小组5个样品的成骨细胞（或破骨细胞）等量混合，抽提mRNA，逆转录标记cDNA,基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞的基因表达谱（基因芯片为大鼠Oligo基因芯片，6000个cDNA的微阵列，由北京博奥生物芯片有限公司协助制备）。3）、II组：按“超”负荷力值加载后，随机选5只大鼠，分成6小组，分别在1h加载后，以及24h，48h,6d加载（每天3次，每次1小时）后取下大鼠股骨，其余方法同I组。4）、III组：无

31、负荷加栽组，与上两组同期取种植体周围骨组织，抽提成骨细胞和破骨细胞mRNA，逆转录标记cDNA,基因芯片检测成骨细胞和破骨细胞基因表达谱。四）、采用RT-PCR检测不同负荷下表达差异明显的基因拟对在骨形成和骨吸收中基因表达差异（上调或下调）超过5倍的基因，应用RT-PCR法进行基因表达水平的半定量测定，并结合基因数据库分析此生理过程中涉及功能性基因的种类和变化的幅度，以期阐明“标记”基因。1）、样品在做基因芯片检测之前，提取部分细胞，标记，液氮冻存备用。2）、据基因芯片检测的结果，对I、II组基因表达差异最大的数个基因通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法，抽提细胞的总RNA，逆转录，再通

32、过随机引物法对此类基因进行基因表达水平的半定量分析。结合基因数据库，分析这些基因的主要功能及作用。五）、统计学分析处理统计学分析各项实验结果，明确间断压力下的骨形成和骨破坏过程中，成骨细胞和破骨细胞特异性基因的表达和时序变化，通过体内外实验的对比，探讨成骨细胞和破骨细胞在间断力学刺激下的耦联机制。 生理负荷 超负荷体外培养的成骨(OB)细胞和破骨细胞(OC)体外培养的成骨细胞(OB)和破骨细胞(OC) 基因芯片 基因芯片 体外OB、OC基因表达谱的时序变化体外OB、OC基因表达谱的时序变化研究骨形成到骨吸收质的变化过程中，OB、OC基因调控机理。RT-PCR法检测OB、OC表达差异最大的几个基

33、因；结合基因数据库，明确“标记”基因及功能。骨界面OB、OC基因表达谱的时序变化骨界面OB、OC基因表达谱的时序变化基因芯片 基因芯片 提取骨界面取材的OB和OC提取骨界面取材的OB和OC激光捕获激光捕获体内种植体骨界面区域的骨组织体内种植体骨界面区域的骨组织 生理负荷超负荷可行性分析：1、项目是在大量查阅国际最新相关文献资料，并结合申请者本人相关的前期工作的基础上，采用了多种学科、多种技术相结合的综合性研究方法，从而保证了立题的新颖性、科学性和可靠性。2、本项目在技术思想上是课题“？”的延续和发展。在前期相关的研究中发现，在生理范围内，机械应力的增加导致与成骨相关基因表达（比如转化生长因子-

34、1、骨形成蛋白-4）的激活或上调，有理由相信可能存在破骨相关基因的灭活或下调（或相对水平的下调）。反之亦然。此二者对比，结合相同条件下体内外基因表达谱的异同，我们预期能筛选出与骨形成、骨破坏以及信息耦联密切相关的特异性基因，并可进一步研究其互关系。3、项目申请者多年从事生物力学、分子生物学的相关的研究，在临床和科研上有着多年的组织和实践经验。近年先后承担省科技攻关计划市科委基金等科研项目积累了与该项目相关的工作经验，特别是将力学刺激传递到骨系细胞的动物实验模型的建立，为本项目的完成奠定了基础。4、与课题相关的基因芯片检测技术比较成熟，课题组成员有一定的工作经验和技术，已同生物科技有限公司，生物

35、芯片有限公司达成协议，基因芯片的制备和相关技术支持可以得到保证。5、激光捕获显微分离技术（Laser Capture Microdissection LCM）在软组织应用以很成熟，课题组成员有在骨松质捕获细胞的经验，所需设备已具备。4、本项目的特色与创新之处。1）不仅从体外，还通过动物模型从体内探讨力学刺激作用下成骨细胞和破骨细胞上千个基因的动态表达。2）首次应用基因芯片技术从整个基因组的宏观水平，探寻不同负荷状态下，骨形成和骨破坏的基因调控机制，以及成骨细胞和破骨细胞在其中的作用，及其可能的耦联机制。3）在体内实验中采用激光捕获显微分离技术（LCM），从骨组织与人工材料界面捕获所需的成骨细胞

36、和破骨细胞，使相关基因的检测更加准确。4）通过本课题的研究可能引出的思考： A）不同类型的应力，不同的作用方式和时间均有可能影响基因的表达，本课题为简化实验，突出重点，选用间断力学刺激作为力的作用形式。根据本课题所测得的特异性基因表达的结果为基础，针对不同应力形式对骨系细胞基因表达的影响是否存在差异这一尚存争论的问题，通过进一步的实验，应用聚类分析等方法，可以给出基因水平的判别。B）、若体内实验发现的特异性基因表达是体外细胞水平实验中没有出现的，则很有可能是成骨细胞和破骨细胞耦联的作用方式，可为进一步研究两者相互作用方式提供实验基础。C）、骨形成和骨吸收不但和应力有关，也和激素、生长因子等有密

37、切的关系，而这是本课题没有涵盖的，这也为我们提出了以后发展的方向-结合蛋白质组学层面的研究，以期阐明骨形成、骨破坏的分子机理。5、 年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划本项目需3年时间完成，自2005年1月-2007年12月1、2005.1-2005.7 完成研究方法技术路线中的第一部分，即动物实验模型的建立和力学指标的确立。2、2005.7-2005.12完成研究方法技术路线中的第二部分，即体外培养的成骨细胞、破骨细胞在间断力学刺激下基因表达谱的基因芯片分析。3、2006.1-2006.9完成研究方法技术路线中的第三部分，即体内骨组织不同负荷和时间下成骨细胞和破骨细胞基因表达谱基因芯片检

38、测。4、2006.10-2006.12完成研究方法技术路线中的第四部分：即采用半定量RT-PCR检测不同负荷下表达差异明显的基因。5、2007.1-2007.12完善补充实验，数据分析总结，完成论文。预期研究成果成果以论文形式发表并组织鉴定。1）、明确生理性负荷和超负荷的力学参数和时间参数，以及相应的骨组织形态学的改变。2）、生理负荷和超负荷下成骨细胞和破骨细胞的生物学性状。3）、明确间断力学刺激下成骨细胞和破骨细胞的特异性基因表达及时序变化。4）、探寻新的未知的与骨形成或骨破坏密切相关的基因，为进一步的深入研究提供新的线索。5）、发现反映从骨形成到骨破坏这个质的变化过程中的“标记”基因，进而

39、探讨其临床意义。6）、通过体内试验，明确无负荷、生理负荷和超负荷状况下，骨组织基因表达的差异。结合体外细胞水平的实验，探讨骨形成和骨破坏的基因调控机制以及成骨细胞和破骨细胞的耦联机制。（二）研究基础与工作条件2、工作条件1）、配有相应的种植仪器和种植材料，动物实验技术成熟, 加力装置已具备。2）、Zwick1454自动材料万能试验机（Ulm,Germany）及气压加载容器可以保证课题需要。3）、实验室现有的主要实验仪器： （1）、病理制片配套设备 （2）、石蜡、冷冻、恒冷、超薄切片机 （3）、显微像系统 （4）、荧光、相差、倒置、自动照相显微镜 （5）、细胞培养全套设备 （6）、荧光分光光度计

40、和紫外分光光度计 （7）、PCR仪、电泳仪 （8）、低温超速离心机 （9）、超低温冰箱 （10）、流式细胞仪 （11）、石英三蒸水发生器 （12）、三维细胞培养器 （13）、分子生物学实验常用设备 （14）、动物实验监测维持设备4）、骨形态计量学涉及的图像分析系统已具备。5）、已经掌握基因芯片检测技术。6、已具备激光捕获显微分离技术和设备。根据本课题要求，部分设备需购买某些零配件以满足实验要求，关键仪器及大型设备已具备，无需购买。课题类别卫生厅编号湖南省医药卫生科学技术研究课题计划（合同）申 请 书课题名称：脑脊液中-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值及临床意义的研究 湖南省卫生厅一九九三年十月制

41、简 表研究课题名称(25字内)脑脊液中-淀粉样蛋白和tau蛋白的正常值 及临床意义的研究 类别A.重点 B.一般 C.青年基金申请金额 2万元起止年月起2002年10月止 2003年9月申请者姓名性别男出生年月 1966年7月专业技术职务主治医师学位博士所在部门工作单位名称所在地性质A.高等院校 B.医疗卫生单位 C.科研单位 D.其它课题组总人数高级中级初级辅助人员博士硕士学士参加单位数52212211 课题组主要成员含负责人姓名年龄专业技术职务年参加月数工作单位项目中的分工签章35主治医师全程负责44副主任医师全程协作40主任医师全程负责31主管技师全程协作28医师全程协作-1-研究内容和

42、意义摘要200字内脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。Tau蛋白是脑细胞内的一种功能蛋白，有形成细胞骨架、组装和稳定微管的作用。正常脑细胞内Tau蛋白磷酸化位点很少，因而不易被磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的含量较少。AD患者脑细胞内Tau蛋白磷酸化位点增多，Tau蛋白呈异常磷酸化，脑脊液中Tau蛋白的含量增多。本研究拟采用放射免疫法检测不同年龄段人群（

43、包括痴呆和非痴呆）脑脊液40、A42和Tau蛋白含量，通过大样本的分析，界定其参考正常值范围，为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。脑脊液中-淀粉样蛋白（-Amyloid Protein, -AP，A）是淀粉样前体蛋白（APP）在分泌酶的作用下裂解出来的含有40-43个氨基酸的蛋白质，脑脊液中A有A40

44、和A42两种形式；两者在正常老年人和Alzheimer病（AD）脑脊液中均存在，A42与AD老年斑形成密切相关。-2-本研究的立项依据和目标本课题研究的意义及同类研究工作国内外研究现状与存在问题，列出主要参考文献随着社会人口逐步进入老龄化阶段，Alzheimer病（AD）已成为人类的第四大死因。AD的研究具有重要的经济意义和社会意义。目前AD的诊断主要靠临床表现、神经心理学测试和影像学检查，缺乏客观的实验室诊断依据。AD的基本病理变化是老年斑和神经元纤维缠结，前者的主要成分是淀粉样蛋白（A），后者的主要成分是Tau蛋白。AD患者脑脊液中A水平是增高还是降低，各家报道不一致1-4。其原因主要与没

45、有分别测定A40、A42和总A有关；且因均采用ELASA法，测出的结果受主客观影响较大，致使A测定的应用价值降低。AD患者脑脊液Tau蛋白水平是增高的，国内外报道是一致的5-6。由此推断：脑脊液Tau蛋白和A联合测定可能会提高实验室诊断AD的应用价值。虽然，国外新近有脑脊液Tau蛋白和A正常值的报道7 ，但目前尚无国人脑脊液Tau蛋白和A的参考正常值。界定国人的脑脊液Tau蛋白和A的参考正常值可为Alzheimer病的诊断提供可靠的实验室依据。参考文献丁新生，程虹，张雪玲，等。脑脊液中淀粉样蛋白检测对老年期痴呆的诊断意义。临床神经病学杂志，2001，1：3-5。吴恺，胡刚，国泓，等。Alzhe

46、imer病患者脑脊液淀粉样蛋白的检测。中华老年医学杂志，1999，1：13-15。王磊，袁锦楣，郝洪军，等。Alzheimer病血清和脑脊液-淀粉样蛋白的测定。中国神经精神疾病杂志，1999，2：102-103。Kanai M,Matsubara E,Isoe K,et al.Longitudinal study of cerebraospinal fluid levels of tau, A1-40,A1-42(43) in Alzheimers disease:A stady in Japan,Ann Neurology,1998,44:17-26.王琨，丁新生，程虹。阿尔茨海默病患者脑脊

47、液Tau、A1-40、A1-42（43）蛋白测及其临床意义。徐州医学院学报，2000，2：109-112。Shoji M,Matsubara E,Kanai M,et al.Combination assay of CSF tau , A1-40 and A1-42 as a biochemical marker of Alzheimers disease.J Neurol Sci ,1998,2:134-140.Sjogren M,et al .Tau and Abeta42 in cerebrospinal fluid from healthy adults 21-93 years of

48、age:establishment of reference values .Clin Chem 2001;47(10):1776-81.-3-2研究内容、研究目标和拟解决的关键问题研究内容、研究目标： 本研究拟通过对不同年龄段非AD和AD病人脑脊液中 A40、A42和Tau蛋白的检测，确定脑脊液中A40、A42和Tau蛋白的参考正常值。为AD的诊断提供实验室依据。拟解决的问题：理论上说，只有痴呆患者（包括AD性和非AD性）的脑脊液A和Tau蛋白异常，正常人、非神经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病患者脑脊液中A40、A42和Tau蛋白含量是一致的。但为证实这一理论，先将非痴呆组分为正常人、非神

49、经系统疾病患者和非痴呆神经系统疾病三个亚组的脑脊液分别检测，如这一理论得到证实，则将这三个亚组的脑脊液A和Tau蛋白的含量视为正常人的含量来分析，以增加样本量，克服真正的正常人脑脊液来源不足的弊端。 -4-3本课题的特色和创新之处及立论根据（与国内外类似研究比较） 脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下腔内的一种无色透明液体，脑细胞的代谢产物可释放到脑脊液中，脑脊液中成分的变化一定程度反应了脑细胞的活动情况。脑脊液取材操作简单，放射免疫法检测受主观干扰因素少，结果可靠。 目前，国内外关于脑脊液A和Tau蛋白检测的报道主要是对已确诊为痴呆的研究，对非痴呆患者脑脊液Tau蛋白和A的检测的报道甚少。本课题拟通

50、过对非痴呆患者的不同人群脑脊液A和Tau蛋白含量的研究，界定其参考正常值，为确诊AD提供实验室依据。 4研究工作的预期结果或成果 预期通过对不同年龄段的非痴呆人群脑脊液Tau蛋白和 A的检测，界定其人群的参考正常值。 -5-5本课题的情报查新情况及结论检索关键词（个）：检索年限（前3年以上）：检索刊物名称（至少有种系国外刊物）：检索手段（光盘、手工、其它）：检索结论：检索机构及检索人盖章-6-二、研究方法和路线拟采取的研究实验方法、步骤、技术路线及可行性、可靠性论证方法、步骤、技术路线：脑脊液的收集：包括所有行腰穿（神经内科和非神经内科住院患者）时的脑脊液，除外有明显出血的脑脊液，经离心沉淀后分管于-20冰箱中保存待测。根据痴呆的临床诊断标准分为痴呆组和非痴呆组，然后再分亚组。详见表。 AD 痴呆组- 非AD 正常人 非痴呆组-非神经系统疾病 非痴呆神经系统疾病 2） 选用相应的试剂合，用放射免疫法测定。3） 实验数据的分析、处理。4） 书写论文。可行性、可靠性论证： 1） 腰穿留取脑脊液化验检查是神经内科诊断疾病常用的方法，因而收集足够的脑脊液是可行的。2） 本院核医学科有一流技术的医技人员和成套设备，能够完成该科题的实验检测。3） 试剂合可在国内外生物技术公司购买。 -7-2、研究工作的总体安排及进度： （1）2002年10月-2003年3月 规范实验程序