Trizol法提取细菌总RNA

1、实验三Trizol法提取细菌总RNA一、实验原理Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织（50-100mg）和细胞（5X106）以及大量的组织（三1g）和细胞（107）均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。二、主要试剂和器材Trizol溶液氯仿异丙醇7

2、5%乙醇0.1%DEPC水超净工作台2.0mL离心管（无Rnase）移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电泳仪凝胶成像系统大肠杆菌三、实验步骤（一）.采用Trizol溶液提取细菌的总RNA挑取大肠杆菌菌单菌落，培养至稳定期，取菌液2.0mL于2.0mL离心管离心得菌体；2、每管加入1mLTrizol溶液，盖紧管盖，激烈振荡15s,室温静置5min4C,12000g，离心10min；取上清转入（约1mL）新的2.0mL离心管中；3、每管加入0.2mL的氯仿（0.2体积Trizol），盖紧盖，剧烈振荡15s；室温静置3min；4C,12000g,离心10min；小心吸取上层水相，转入另一新的2

3、.0mL离心管，测量其体积；（加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。）4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡15s；室温静置3min；4C，12000g，离心10min；小心吸取上层水相，转入另一已编号新的2.0mL离心管；5、加入0.5mL的异丙醇（0.5体积Trizol），轻轻颠倒混匀；室温，静置10min；4C，12000g，离心10min，RNA沉于管底；小心吸去上清；6、加1mL75%的乙醇（预冷），并轻柔颠倒，洗涤沉淀；4C，7500g，离心5min；小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁10min；7、各管用30口LDEPC处理过的双蒸去离子水溶解，55-60C温育5min,分装，

4、-80C贮存(可贮存5周)；.RNA浓度的测定取10吐RNA样品以双蒸水稀释至2mL,转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定260nm、280nm的光吸收值，根据公式计算RNA的浓度。RNA浓度(卩g/UL)二ODX稀释倍数(200)X40(卩g/mL)/1000260纯RNA样品的OD/OD比值为1.82.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，260280可重新用酚/氯仿抽提。该值为2.0时，RNA纯度为最高。.RNA质量检测将RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测23S和16S条带的完整性和它们的比值。一般认

5、为，如果23S和16S条带明亮、边缘清晰，并且23S的亮度在16S条带的两倍以上，贝VRNA的质量较好。将洗净、干燥的电泳槽和模具，水平放置在工作台上；准确称取0.15g琼脂糖加入15mL1XTAE中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以最短时间完全溶解(中火档2min)，待冷却至60C时，加入EB(终浓度为UL/mL)，充分混匀；插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为35mm，置于室温下凝固；待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶12mm；用微量移液器将样品8UL与上样缓冲液2卩L混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的DNA分子

6、量标准作为对照(2000bp)；盖上电泳槽盖，调节电压100V，电泳15min左右；电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存。四、注意事项RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1%DEPC浸泡过夜后，高压蒸气灭菌）。用于RNA实验的试剂，须使用DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净台内操作。2、提取时操作带一次性手套、口罩等，小心、细致、晃动及每次移液要轻；在操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。3、电泳液需新鲜配制。电泳槽和模具需预先进行处理。4、一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好（这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解），跑完电泳立刻观察。5、需要用EB染色，Genefinder染色效果不好，其对双链DNA的效果好。6、器材的处理：尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿