01.蛋白质化学-PPT课件

1、什么是生物化学？ 生物化学是研究生命化学的科学，它在分子水平探讨生命的本质，即研究生物体的分子结构与功能、物质代谢与调节、及其在生命活动中的作用。 绪 论学习内容生物大分子的结构与功能： 蛋白质化学、核酸化学、酶物质代谢及其调节 糖、脂、氨基酸、核苷酸代谢， 生物氧化、代谢联系与调节遗传信息的传递 DNA复制、RNA转录、蛋白质生物合成、 基因表达调控、基因重组与基因工程专题篇 细胞信息传递、癌基因、抑癌基因与生长因子、血液生化、肝胆生化学习生化基本方法与要求基本概念要清楚重点内容要掌握章节之间会联系课后复习很重要第一章蛋白质化学杨笑菡北京大学医学部生化与分子生物学系第一节 蛋白质（prote

2、in）在生命活动中的重要性 核蛋白是最简单的生命形式 烟草花叶病毒阮病毒分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。1. 蛋白质是生命的物质基础2、蛋白质的重要生物学功能3、氧化供能1）生物催化剂：酶2）代谢调节作用：激素 ，受体，G蛋白，等3）防御作用：免疫球蛋白 ，等4）物质转运：血红蛋白 ，等5）运动与支持：肌动蛋白，等6）营养和存储：酪蛋白，卵清蛋白，等7）结构蛋白 ：胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白 ，等8）其他：毒蛋白，甜味剂，等第二节 蛋白质的分子组成一、元素组

3、成：碳 50-55氢 6-8氧 20-23氮 15-17硫 0-3其他 微 量 其中 N含量16蛋白质含量氮含量/16氮含量6.25蛋白质含量？凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据1、主要元素：碳、氢、氧、氮和硫，有些蛋白质还含有少量磷和金属元素。2、特点：各种蛋白质的含氮量很接近，平均含氮量为16%。3、定氮法测定蛋白质含量： 蛋白质含量6.25样品含氮量 1/16%小结二、结构单位氨基酸（amino acid）（一）氨基酸的一般结构式存在自然界中的氨基酸有300多种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20余种，绝大多数蛋白质只由20种氨基酸组成，且属 L-氨基酸（甘氨酸，脯氨酸除外）。 蛋白质 肽

4、 氨基酸水解水解酸/碱/酶氢原子氨基羧基侧链基团-碳原子氨基酸的基本结构H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R 脯氨酸（亚氨基酸） 按其侧链的结构和理化性质分类非极性、疏水氨基酸(非极性R基氨基酸)： Val, Leu, Ile（支链）；Met（含硫）；Phe , Trp （芳香族）；Pro（亚氨基）；Ala（脂肪烃 ）极性、中性氨基酸(不带电荷的极性R基氨基酸) ： Ser, Thr（含羟基）；Tyr（芳香族）；Cys（含硫）；Gln, Asn（含酰氨） ；Gly（无旋光异构）（二）氨基酸的分类 酸性氨基酸（含有两个羧基）： Glu（含羧基）、Asp（含羧基） 碱性氨基酸（含有两个以上氨基）

5、： Arg（胍基）、His（咪唑基）、Lys（氨基）含硫氨基酸：Met、Cys芳香族氨基酸：Phe、Tyr、Trp非极性疏水性氨基酸2. 极性中性氨基酸3. 酸性氨基酸4. 碱性氨基酸蛋白质基本结构单位：L氨基酸 氨基酸：脯氨酸（亚氨基酸）除外 L氨基酸：甘氨酸（无不对称C）除外 氨基酸结构通式：RCH(NH2)COOH 常见氨基酸种类：20种。小结(zwitterion)pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性离子 阳离子阴离子三、氨基酸的理化性质1、两性解离氨基酸的等电点pH pI正电荷 两性离子 负电荷负极移动（电场中） 不移动 正极移动等电点（isoelectr

6、ic point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的pH值称为该氨基酸的等电点。2、紫外吸收：Trp、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm3、显色反应：（1）茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰为570nm，可用于氨基酸定量分析。例外：Pro黄色；Asn棕色等电点（isoelectric point, pI）：在某一pH环境中，氨基酸解离成阳性离子及阴性离子的趋势相等，所带净电荷为零，在电场中不泳动。此时，氨基酸所处环境的pH

7、值称为该种氨基酸的等电点(pI)。等电点计算：两性离子两边的pK值的算术平均值。带电状态判定： pI-pH （正数带正电，负数带负电）紫外吸收：Trp、Tyr和Phe在280nm波长附近具有最大吸收峰，其中Trp的最大吸收最接近280nm小结 （一）氨基酸的成肽反应-羧基和-氨基之间脱去一分子水形成的酰胺键，是蛋白质中氨基酸间最基本的连接方式。三、肽键和多肽链 肽分类、命名* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。* 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(

8、oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。甘氨酰甘氨酸 多肽链蛋白质的基本结构形式多肽链 (NHCHCONHCHCO)多肽链的方向性：从N末端指向C末端。（二）生物活性肽：谷胱甘肽神经肽：脑啡肽、内啡肽、强啡肽、P物质、Y肽肽类激素：催产素、加压素等其他：生长因子；短杆菌S；甜味肽等谷胱甘肽(glutathione, GSH) 体内许多激素属寡肽或多肽1、连接方式：肽键肽键(peptide bond)：一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基缩水而成的酰胺键称为肽键。（CONH）肽平面(peptide unit)：由肽键中的四个原子（-CO-NH-）和与

9、之相邻的两个碳原子共同构成的刚性平面（CCONHC）。2、生物活性肽：谷胱甘肽：Glu-Cys-Gly，Glu以羧基形成肽键 3、蛋白质的基本结构形式：多肽链多肽链 (NHCHCONHCHCO)多肽链的方向性：从N末端指向C末端。小结四、蛋白质的分类1、按照组成分类：单纯蛋白、结合蛋白单纯蛋白：只有氨基酸组分结合蛋白：氨基酸组分其他组分（辅基）2、按照结构分类：单体蛋白、寡聚蛋白单体蛋白：只有一条多肽链寡聚蛋白：数条多肽链非共价相互作用超家族（super-）、家族（family）、亚家族（sub-） 3、按照生物功能分类：酶、调节蛋白、转运蛋白、运动蛋白、防御蛋白、营养蛋白、储存蛋白、结构蛋白

10、、毒蛋白4、根据形状分类：纤维蛋白、球状蛋白第三节蛋白质的分子结构一级结构(primary structure)二级结构(secondary structure)三级结构(tertiary structure)四级结构(quaternary structure)纤维状蛋白质球状蛋白质一、蛋白质的一级结构(primary structure) 多肽链中氨基酸的排列顺序。 半胱氨酸 +胱氨酸二硫键-HHN末端C末端牛核糖核酸酶二硫键一级结构是指蛋白质的多肽链中氨基酸的排列顺序一级结构体现生物信息：20n .多样一级结构是空间结构及生物活性的基础.特异一级结构的连接键：肽键（主要）、二硫键小结-螺旋

11、 (- helix) -折叠 (- pleated sheet)-转角(- turn)无规则卷曲（random coil）二、二级结构肽键具部分双键性，不能自由旋转肽键中的四个原子（-CO-NH-）和与之相邻的两个碳原子（C1、 C2）位于同一刚性平面内，称为肽单元 。肽键上H与O的方向几乎总是相反，称反式肽单元（trans-peptide unit），该构型更稳定。CNHHHORRCNHHHORR1.肽单元2.-螺旋存在于纤维状蛋白质（角蛋白：皮肤、毛发、指甲、和角）和球状蛋白质中。3.-折叠(-pleated sheet)存在于纤维状蛋白质（ -角蛋白：蚕丝、蜘蛛丝中丝心蛋白）和球蛋白中。

12、-转角一般由四个氨基酸组成，常见氨基酸：Pro,Gly以主链间氢键维持稳定。多肽链中180度回折处形成的特定构象。没有确定规律性的肽链结构，存在于球状蛋白质中。（常常是酶的功能部位） 4.无规卷曲1、-螺旋(-helix)右手螺旋：3.6个AA/圈，螺距0.54nm；氢键维系：链内氢键（AA1AA4），平行长轴；侧链伸出螺旋蛋白质的二级结构是指多肽链骨架中原子的局部空间排列，不涉及侧链的构象，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，主要有-螺旋、-折叠、-转角和无规则卷曲。维持二级结构的力量为氢键。小结2、-折叠(-pleated sheet)多肽链充分伸展，肽平面折叠成锯齿状；侧链交错位于锯

13、齿状结构的上下方；氢键维系：氢键的方向垂直长轴；可有顺平行片层和反平行片层结构。3、其它（1）肽链主链出现的180回折部分称-转角。（2）蛋白质分子中那些没有确定规律性的部分肽链构象称为无规卷曲。（三）蛋白质的三级结构次级键介导蛋白质高级结构形成1、疏水键2、离子键3、范德华力疏水作用蛋白质的三级结构是指在一条多肽链中所有原子的整体空间排布，包括主链和侧链。三级结构的形成使得在序列中相隔较远的氨基酸侧链相互靠近。 长度缩短：球形、椭球形、杆状，等多数同时含有-螺旋和-折叠氨基酸位置由侧链极性决定：非极性（内）、极性（表面，少数内部）、带电（表面）次级键维系：疏水键、盐键、氢键、范德华力、二硫键

14、功能区：表面或特定部位小结（四）、蛋白质的四级结构血红蛋白四聚体亚基(subunit)：寡聚蛋白中的单条独立的多肽链，具有独立的一、二、三级结构，单独存在时一般无生物学活性。亚基之间以非共价键联系，亚基可以相同或不同。亚基之间以非共价键联系，包括疏水键（主要）、盐键、氢键、范德华力亚基可以相同或不同第四节蛋白质结构与功能的关系蛋白质一级结构是空间结构和生物功能的基础，一级结构决定空间结构；但一级结构并非决定空间结构的唯一因素。空间结构是生物活性的直接体现。一、一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间结构的基础 例如：核糖核酸酶的变性与复性 天然状态，有催化活性 尿素、 -巯基乙醇 去除尿素、-

15、巯基乙醇非折叠状态，无活性一级结构适当的溶液环境分子伴侣（chaperone）酶：蛋白质二硫键异构酶，肽基脯氨酸顺-反异构酶影响多肽链折叠的因素图解：助人为乐的分子伴侣太太很快出现在需要她尽力而为的场所（新生肽链的折叠，越膜，应激反应等情况），她主动去发现她应该帮助的正在成长的新生肽姑娘（识别折叠中间物），热情地伸出友谊之手（相互作用和结合），并发出警戒之言不！不！别往哪儿走！，防止她们误入歧途掉进不可自拔的死亡深渊（防止错误的相互作用导致的无效折叠和不可逆聚集），从而帮助她们沿着朝向正确目标的光明大道前进（有利于有效折叠成功能蛋白的正确折叠途径）。新生肽姑娘健康地成长（正确折叠）。折叠好的蛋

16、白质小姐愉快地，昂首阔步地准备去做自己的贡献（折叠成特定的空间构并获得生物活性的功能蛋白 )分子伴侣帮助新生肽链正确折叠 生物名称 不同氨基酸数 生物名称 不同氨基酸数黑猩猩 0 恒河猴 1猪、牛、羊 10 马 12鸡 13 海龟 15金枪鱼 21 小蝇 25小麦 35 酵母 44不同生物和人的细胞色素c 中氨基酸组成的差异（二）蛋白质一级结构的种属差异与分子进化 狗人猴 马骡 鲸 兔猪袋鼠企鹅鸡 鸭响尾蛇龟苍蝇 蛾脉孢菌属念珠菌属面包酵母菌小麦牛 蛙金枪鱼动 物爬行动物两栖动物鱼哺乳动物鸟昆 虫植 物脊椎动物从细胞色素C的一级结构看生物进化N-val his leu thr pro glu

17、glu C(146) HbSHbAN-val his leu thr pro val glu C(146) 分子病（molecular disease） ：由于蛋白质分子发生变异所导致的疾病。镰刀形红细胞贫血病（三）蛋白质的一级结构与分子病： 结构改变，功能改变正常红细胞镰形红细胞1、一级结构中的保守序列决定空间结构（1）不同蛋白质之间的比较：相似结构相似功能、不同结构不同功能（2）同一蛋白质不同状态的比较：一级结构决定空间结构【经典举例】蛋白变性与复性（3）保守序列、保守氨基酸改变，功能改变；保守氨基酸不变，功能不变【经典举例】分子病小结2、一级结构并非影响空间结构的唯一因素分子伴娘(mol

18、ecular chaperons，分子伴侣)：在蛋白质加工、折叠形成特定空间构象及穿膜进入细胞器的转位过程中起关键作用的一类蛋白质。与未折叠的肽段（疏水部分）进行可逆的结合，辅助二硫键的正确形成；引导肽链的正确折叠并集合多条肽链成为较大的结构；可以解聚错误聚合的肽段，防止错误发生。肌红蛋白与血红蛋白的结构 二、空间结构与功能的关系空间结构体现生物活性：结构相似，功能相似肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。空间结构体现生物活性：结构改变，功能改变一个寡聚体蛋白

19、质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应(cooperativity) 。 正协同效应(positive cooperativity)：促进作用负协同效应(negative cooperativity)：抑制作用别构效应（变位效应，allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位与小分子化合物结合后，引起空间构象改变，从而促使生物学活性变化的现象。疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转

20、变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。PrPc-螺旋PrPsc-折叠正常疯牛病朊病毒致病过程中的构象变化示意图1、空间结构体现生物特异性2、空间结构体现生物活性3、空间结构的灵活性，体现了生物活性的可调节特性空间结构中的特定区域体现生物活性小结别构效应（别位效应、变位效应，allosteric effect）：蛋白质分子的特定部位（调节部位）与小分子化合物（效应物）结合后，引起空间构象发生改变，从而促使生物学活性变化的现象称为变构效应。包括正协同、负协同效应【经典举例】血红蛋白（Hb）：由22四聚体组成，每个亚基含有1个血红素辅基；Hb的氧解离曲线呈“S”型。多种空间构象，多种活性状态4、空间

21、构象并非生物活性的唯一影响因素【举例】低温下酶活性低，但并不影响构象；盐析时沉淀的酶无活性，但构象不变。 5、蛋白构象疾病：错误构象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。老年痴呆疯牛病亨汀顿舞蹈病第五节蛋白质的理化性质及分离纯化 1、蛋白质的两性电离 一、理化性质 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点

22、。2、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。3、蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜酸碱酸碱溶液中的蛋白质+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉+带正电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜酸碱酸碱4、蛋白质的沉淀（Pre

23、cipitation）5、变性（Denaturation）、结絮和凝固概念：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间构象破坏，导致若干理化性质和生物学性质的改变。变性因素：1）物理因素：高温、高压、射线等2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐等 变性后的表现：1）生物学活性消失2）理化性质改变变性的意义：高温、高压、紫外线杀菌；防止酶制剂失活，等5、蛋白质的呈色反应（1）茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质水解后产生的氨基酸可发生茚三酮反应。（2）双缩脲反应(biuret reaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲

24、反应可用来检测蛋白质水解程度。1、两性解离与等电点：同“氨基酸两性解离”2、紫外吸收：最大吸收波长280nm 3、胶体性质：不能透过半透膜4、沉淀、凝固蛋白质在溶液中维持稳定的因素： 表面电荷、水化层（溶剂化层）变性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定变性（1）沉淀：不稳定蛋白质从溶液中析出（2）结絮：变性蛋白质的絮状沉淀，沉淀可溶于强酸、强碱（3）凝固：沉淀结块，凝块不溶于强酸、强碱小结沉淀/变性沉淀变性（1）变性：在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。变性不涉及一级结构的变化。理化性质的变化：紫外吸收、化学活性及粘度上升，易被蛋白酶水

25、解；溶解度下降、结晶能力丧失。5、变性(denaturation)、复性(renaturation)（2）复性（3）应用利用变性：酒精消毒，高压灭菌防止变性：低温保存生物制品取代变性：乳品解毒(用于急救重金属中毒)6、呈色反应：双缩脲反应，等双缩脲反应可检测蛋白质的水解程度二、蛋白质的分离纯化1、透析及超滤法* 透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。2、盐析、有机溶剂沉淀及免疫沉淀 *丙酮、乙醇等有机溶剂，可破坏蛋白质的水化层，在04低温下，使蛋白质沉淀。环境温度

26、高等不良因素影响下，有机溶剂可促使蛋白质变性。*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 * 免疫沉淀法：利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 3、电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。根据支撑物不同，分为薄膜电泳、凝胶电泳等几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。4、层析(chromatography)或色谱法待分离蛋白质溶液（流动