2017修订生物化学实验指导书

1、精选优质文档-倾情为你奉上精选优质文档-倾情为你奉上专心-专注-专业专心-专注-专业精选优质文档-倾情为你奉上专心-专注-专业生物化学实验指导书2017年03月28日修订目 录实验一 生物化学实验常用仪器设备及使用实验二 甲醛滴定法实验三 糖的定量：3，5二硝基水杨酸比色法 实验四 粗脂肪提取和含量测定 实验五 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳实验六 动物组织中脱氧核糖核酸的制备及测定实验一 生物化学实验常用仪器设备及使用一、生物化学实验须知1实验室规则(1) 实验课必须提前5 分钟到实验室,不迟到,不早退，应自觉遵守课堂纪律。(2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品

2、和试剂的纯净, 严防混杂污染。(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 由课代表收齐交给教师。(6)仪器损坏时, 应如实向教师报告, 真填写损坏仪器登记表, 然后补偿一定金额。(7)每

3、次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。2实验记录实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。3实验报告的书写实验结束后,应及时整理和总结实验结果, 写出实验报告。（1） 标题标题应包括实验名称、实验时间、实验室名称、实验组号、实验者及同组者姓名、实验室条件。（2） 实验目的（3） 实验原理应简述基本原

4、理，不要完全照抄实验指导书。（4）操作步骤操作步骤(或方法)可以采用流程图的方式或自行设计的表格来表达。（5） 实验结果将实验中的现象、数据进行整理、分析，得出相应的结论。建议尽量使用图表法来表示实验结果，这样可以使实验结果清楚明了。（6） 讨论包括对实验结果及观察现象的小结、对实验中遇到的问题和思考题的探讨以及对实验的改进意见等。4生物化学实验课评分标准 实验预习情况（10%） 实验操作情况（20%） 实验报告情况（30%） 实验考试成绩（40%）二、生物化学实验仪器简介及实验室参观仪器设备名称型号、规格国别、厂家出厂日期冷冻离心机3K30德国SIGMA公司2004-11-01基因扩增仪PC

5、T-220美国MJ公司2004-11-01荧光扫描仪Per Sonal4100A美国Axon公司2004-11-01凝胶成像仪B10-BAD CELOOCEQ*无2005-05-01石英晶体分析仪QCM922美国A.M.T公司2004-07-01纳米粒度及Zeta电位分析仪ZEN 3601英国公司2005-11-01接触角测定仪OCA20法国DIG公司2005-11-01生物安全柜LB2-4A1新加坡公司2005-11-01喷射式生物芯片制备仪Nano Plotter.NP1.2法国Gesim公司2005-11-01DNA合成仪ASM-800俄罗斯Biosset公司2005-11-01荧光倒置

6、显微镜TE2000-U日本尼康公司中国2005-11-01全自动比表面孔径测量分析仪NOVA 2000e美国康塔公司2005-11-01X射线衍射仪D8 Advance法国布鲁克公司2005-11-01光度计TD 20/20n美国普洛麦格公司2005-11-01超临界流体萃取设备HA221-50-06海安华安石油科研仪器有限公司2006-10-01电化学工作站CHI660B*上海辰华仪器公司2005-03-01无氧无水手套箱Universal1220/1000/900上海米开罗那机电公司2005-11-01生物发哮智能控制系统GBIL-10LC*镇江东方生物工程技术公司2005-11-01双光

7、束紫外可见分光光度计TU-1901*北京普析通用仪器公司2005-03-01扫描电子显微镜S-3000N SEM日本日立公司2006-12-11自动核酸蛋白测定仪U-0080D*日本日立公司2008-05-28实时定量PCR仪Option 2 BIO-RAD美国ABI公司2010-06-28梯度PCR扩增仪Veriti美国ABI公司2014-06-06傅立叶变换红外光谱仪Frontier美国PE公司2014-06-06荧光基因检测仪Nano瑞士Roche公司2014-06-06基因扩增仪9700美国ABI公司2014-06-06二氧化碳培养箱Galaxy 170S英国NBS公司2014-06-

8、06超纯水机PURELAB-flex英国ELGA公司2014-06-06超低温冰箱DW-86L490青岛海尔特种电器公司2014-12-23振动样品磁强计HH-15南京南大仪器厂2014-10-30全自动多功能酶标仪MK3美国热电公司2015-04-28电化学工作站CHI660E上海辰华2015-06-08发酵设备6010T上海汇和堂2015-06-10微电泳分析系统Qsep 100台湾Bioptic公司2015-06-30梯度PCRMC nexus德国EPPendorf公司2015-06-30荧光定量PCRLightcycler 96瑞士Roche公司2015-06-30低温热性能测试系统D

9、SCQ20-TGAQ50美国TA公司2015-06-30凝胶成相系统FX5法国vilber公司2015-06-30快速核酸/蛋白分析仪D30德国EPPendorf公司2015-06-30高速离心机5424德国EPPendorf公司2015-06-30生物化学实验课所用仪器高速组织匀浆机FSH-2索氏提取器SXT-6分光光度计T6全温培养摇床HNY-200D干热灭菌器GR-30冰箱KK25V61TI台式离心机5417C循环水泵SHZ-3A电子天平AUY220DNA扩增仪S630紫外可见分光光度计T6新世纪琼脂糖水平电泳槽DYCP-31D双稳定时电泳仪DYY-6C实验二 甲醛滴定法目的了解并掌握甲

10、醛滴定法的原理和方法。原理氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡： 水溶液中的氨基酸为两性离子，不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合，形成NHCH2OH，N(CH2OH)2等羟甲基衍生物，NH3+上的H+游离出来，这样就可以用碱滴定NH3+放出的H+，测出氨基酸，从而计算氨基酸的含量。 如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量。如样品为多种氨基酸的混合物（如蛋白质水解液），则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。此外，脯氨酸与甲醛作用后，生产不稳定化合物，致使滴定结果偏低；酪氨酸的酚基结构，又可使滴定结果偏高。甲醛滴定发常用以测定蛋白质的水解程度，随

11、水解程度的增加，滴定值也增加，滴定值不再增加、保持恒定时，表明水解作用已完全。仪器、试剂、材料仪器100ml锥形瓶（3）；碱式滴定管25ml（1）；吸管2.0ml（2）、5.0ml（2）、10ml（1）。试剂0.5%酚酞乙醇溶液：称0.5g酚酞溶于100ml 60%乙醇。0.05%溴麝香草酚蓝溶液：0.05g溴麝香草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液。1%甘氨酸溶液：1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。标准0.100mol/L氢氧化钠溶液：可用0.100mol/L标准盐酸溶液标定。中性甲醛溶液：甲醛溶液500ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/L NaOH溶液，使溶液呈微粉红色，

12、临用前中和。操作方法将3只100ml锥形瓶标以1、2、3号。于1、2号瓶内各加甘氨酸（或样品）2.0ml及蒸馏水5ml；于3号瓶内加蒸馏水7.0ml。向3只锥形瓶中各加中性甲醛溶液5.0ml，0.05%溴麝香草酚蓝溶液2滴及0.5%酚酞乙醇溶液4滴。然后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH 8.79.0）。溶液颜色由黄绿紫，紫色为滴定终点。结果处理m =（V1V0）1.40082式中 m：1 ml 氨基酸溶液中含氨基酸氮的质量（mg）； V1：滴定样品消耗NaOH溶液的体积（ml）； V2：滴定空白消耗NaOH溶液的体积（ml）； 1.4008：每毫升0.1 mol/L氢氧化

13、钠溶液相当的氮质量（mg/ml）注意事项临近终点时应仔细滴定，切忌滴过量。甲醛有毒，若不慎接触皮肤，应立即用水冲洗。实验过程应保持良好的通风。标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。中性甲醛溶液在临用前配制，若已放置一段时间，则使用前需要重新中和。本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作要按分析化学要求进行。脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定毫升数偏低。而酪氨酸的滴定毫升数结果偏高。思考题甲醛法测定氨基酸含量的原理是什么？为什么NaOH溶液滴定氨基酸NH3+上的H+，不能用一般的酸碱指示剂？测氨基酸的

14、含量时，甲醛溶液为何事先要加入酚酞并用NaOH滴定至微粉红色？实验三糖的定量：3，5二硝基水杨酸比色法一、实验类型验证性实验二、实验目的1、了解多糖的水解2、掌握3，5二硝基水杨酸法测定糖含量的原理与方法3、掌握721紫外可见分光光度计的用法三、预习要求预习书中糖类化学及其分光光度计的使用。四、实验原理还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸

15、。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比，在波长为540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。单糖都是还原糖，均可以利用其还原性进行定量。双糖和多糖等则不一定就是还原糖，如蔗糖是非还原性的、淀粉的还原性很小。利用糖的溶解度不同，可以把还原糖和非还原糖分离开，然后利用多糖的酸水解，使之转化为有还原性的单糖，从而可以使多糖也可以利用还原性进行定量。借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量。当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1-= 0

16、.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。计算公式如下：五、实验材料及设备1、材料：面粉2、仪器：分光光度计(72型)，玻璃比色皿（1cm），电子天平（0.01mg），恒温水浴箱3、器皿：刻度试管（25mL以上），容量瓶（100mL），移液管（1mL、2mL、10mL），量筒（50mL），锥形瓶（100mL），烧杯（250mL、50mL），滴管，玻璃漏斗，洗耳球，滤纸（11cm），pH试纸（69），坐标纸，洗瓶（500mL），白瓷反应板，试管架，移液管架，试管夹，玻棒4、溶液或试剂（1）葡萄糖标准液（1mg/mL）：预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用

17、蒸馏水溶解后，移至500mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4保存期约一星期）。若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。（2）3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：将5.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于200mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），接着加入500mL含130g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解后，定容至1000mL，储存于棕色瓶中。暗处保存备用。将5.0 g 3,5-二硝基水杨酸，加水适量，水浴45度；慢慢加入200 mL 2N NaOH溶液中（不适宜用高温促溶），同时不断搅拌（注意保持溶液的温度不能超过48度；温度高了，溶液颜色

18、变黑），直到溶液清澈透明；接着加入500 mL含130 g酒石酸钾钠的溶液，混匀。再加入5 g结晶酚（苯酚）和5 g亚硫酸钠顺序最好不要更改！，继续45 水浴加热，补加水适量，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。（3）碘液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL水中。（先在水中加入碘化钾，然后加入碘单质，就可以了。 碘单质易溶于碘化钾水溶液，但难溶于水。）（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%（V/V）的乙醇中。（5）HCl溶液（6N）：取500mL 12N HCl，用水稀释至1000mL。（6）NaOH溶液（6N）：取24

19、0g NaOH，加水溶解，定容至1000mL。 六、实验步骤1、样品中总糖的提取（1）取材：称取0.7g面粉，准确记录实际质量（W），放入100mL锥形瓶中。（2）溶解：先用几滴蒸馏水调成糊状；加入15mL蒸馏水；再加入10mL 6N HCl，搅匀。（3）水解：置于沸水浴中水解30分钟。用玻璃棒取一滴水解液于白瓷板中，加1滴碘液，检查淀粉水解程度。如显蓝色，表明未水解完全，应继续水解。如已水解完全，则不显蓝色，可以取出沸水浴中的锥形瓶，冷却。（4）中和：加1滴酚酞指示剂，加入10mL 6N NaOH中和至微红色。（5）定容：将溶液转移至100mL容量瓶（B1）中，定容。（6）过滤：用滤纸过滤。

20、（注意，滤纸不能用蒸馏水湿润）（7）稀释：精确吸取滤液10mL，移入另一个100mL容量瓶（B2）中，定容。（B2）液作为总糖待测液备用。2、标准曲线制作及样品测定取8支25mL刻度试管（或8个25mL容量瓶），按下表所示顺序操作。管号操作空白标准葡萄糖浓度梯度样品0123451葡萄糖标准液(mL)0.20.40.60.81.02样品待测液(mL)1.01.03蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.01.01.04DNS试剂(mL)各2.05反应各管混匀，沸水浴5分钟6定容冷却；分别用蒸馏水定容至25mL7比色以0号管为空白参比，测定 540nm处的吸光度8记录吸光度（A540）3、

21、结果处理由05号管的数据，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，A540为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；求两个样品管A540的平均值 eq o(sup 9(),A)540；由 eq o(sup 9(),A)540从标准曲线中求样品管中葡萄糖的含量(mg)；计算你所取的生物材料中总糖的百分含量。七、思考题：1、在样品的总糖提取时，为什么要用浓HCl处理？而在其测定前，又为何要用NaOH中和？2、标准葡萄糖浓度梯度和样品含糖量的测定为什么要同步进行？ 3、比色测定操作要点及其基本原理是什么？比色测定为什么要设计空白管？4、总糖包含哪些化合物？用水解后的还原糖含量计算总糖含量时为什么要乘以0.9？实验四粗

22、脂肪提取和含量测定一、实验类型验证性实验二、实验目的1、掌握粗脂肪索氏（Soxhlet）提取的原理和测定方法。2、熟悉和掌握重量分析的基本操作，包括样品的处理、定量转移、烘干、恒重等。三、预习要求预习书中脂类化学及其天平的使用。四、实验原理本法为重量法，该法适用于固体和液体样品，用非极性溶剂将脂肪提出后进行称量。通常将样品浸于非极性溶剂，如乙醚或沸点为30-60度的石油醚，借助于索氏提取管进行循环抽提。本法提取的脂溶性物质为脂肪类似物的混合物，其中含有脂肪、游离脂肪酸、磷脂、酯、固醇、芳香油、某些色素及有机酸等，因此，称为粗脂肪。用该法测定样品含油量时，通常采用沸点低于60度的有机溶剂。此时，

23、样品中结合状态的脂类（脂蛋白）不能直接提取出来，所以该法又称为游离脂类定量测定法。五、实验材料及设备1、材料：花生2、仪器：索氏提取装置，电子天平（0.01mg），烘箱3、器皿：研钵，滤纸，竹镊子或不锈钢镊子4、溶液或试剂：石油醚（30-60度）六、实验步骤1、样品的准备将花生在80度烘箱内烘去水分，烘干时需避免过热。冷却后准确地称取1克左右(M1)放入研钵中研碎，再用滤纸将样品包裹好放入索氏提取管内（注意：勿使纸包内样品高于提取管的虹吸部分）。研磨后的研钵应用滤纸擦净，并将滤纸放入提取管内。用少量溶剂洗涤研钵，将溶剂倒入提取管中。2、抽提洗净提取瓶于105度烘干至恒重，记下其重量（M2）。装

24、入石油醚达提取瓶容积的一半，连接提取器各部分，不能漏气（不能用凡士林或真空脂）。3、加热提取使石油醚每小时循环10-20次，约2-2.5小时，用滤纸粗略判断脂肪是否提取完全。4、溶剂蒸除拆除索氏提取器(若提取管中仍有少量提取液，倾斜使其全部流到圆底烧瓶中)，安装冷凝管进行蒸馏。蒸馏蒸去提取瓶中石油醚（必须蒸去所有溶剂才能干燥）。5、称量计算 烘干已蒸去溶剂的提取瓶至恒重。在天平上称重，计录重量（M3）。粗脂肪% = (脂肪重M3M2) 样品重M1 100%七、思考题：本实验装置磨口处为什么不能涂抹凡士林或真空脂？ 附录：索氏提取工作原理又名沙式提取，利用溶剂的回流和虹吸原理,对固体混合物中所需

25、成分进行连续提取。萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。然后将固体物质放在滤纸套内，置于提取器2中。提取器2的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶5相连接，上面接回流冷凝管1。加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管4上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取。当提取筒中回流下的溶剂的液面超过索氏提取器的虹吸管3的最高处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质。随温度升高,再次回流开始。如此重复，使固体物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。每次虹吸前,固体物质都能被纯的热溶剂所萃取,溶剂反复利用,缩短了提取时间,所以萃取效率较高。实验五血清蛋白的醋酸纤维薄

26、膜电泳一、实验类型验证性实验二、实验目的1、掌握醋酸纤维薄膜电泳的操作。2、熟悉电泳技术的一般原理。三、预习要求预习书中蛋白质化学及其电泳技术。四、实验原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120 um，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。五、实验材料及设备1、材料：血清样品，2、仪器：常压电泳仪，水平电泳槽3、器皿：醋酸纤维薄膜(28 c

27、m)，点样器(或微量注射器 100uL)，培养皿(13cm)，滤纸(11cm)，玻璃板（108 cm），竹镊子，白瓷反应板4、溶液或试剂：（1）巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.07) 巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水至1000mL。（2）染色液 含氨基黑10B 0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL(可重复使用)。（3）漂洗液 含甲醇或乙醇45mL、冰醋酸5mL、水50mL。（4）透明液含无水乙醇7份，冰醋酸3份。六、实验步骤1、浸泡用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。2、点样把膜条从缓冲液中取出，夹

28、在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)。将点样器在放置在白瓷反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端23cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。3、制作滤纸桥先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥(它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”)。4、电泳在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室，通电。调节电压至160V，电

29、流强度0.40.7 mAcm(毫安厘米)，电泳时间约为25分钟。5、染色电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。6、漂洗将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。定量测定时，可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡23分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。七、思考题：1、醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点?2、电泳图谱清晰的关键是什么? 如何正确操作?实验

30、六动物组织中脱氧核糖核酸的制备及测定一、实验类型验证性实验二、实验目的1、了解从动物组织提取脱氧核糖核酸的原理。2、掌握盐溶液法从动物组织提取脱氧核糖核酸的操作技术。三、预习要求预习书中核酸化学及其离心机的使用方法。四、实验原理细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。细胞破碎后，两种核蛋白将混杂在一起。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15 mol/L NaC1的稀盐溶液中，核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水

31、中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，所以要及时采取抑制酶活的措施。为此，在实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2离子，使DNase活性降低；同时，

32、整个分离制备的过程均在4以下进行，以减少DNase的降解作用；最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性，失去酶活性。如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来，但DNA链的双螺旋结构使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能

33、用细的吸头反复吹吸。只要防止DNase污染和高盐浓度条件下，液体DNA能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入20冰箱或液氮冷冻保存。DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。五、实验材料及设备1、材料：鸡肝脏（其他动物肝脏也可以），冰，盐或NaCl2、仪器：组织捣碎机，玻璃匀浆器，常速冷冻离心机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计3、器皿：石英比色皿（1cm）、离心管（10mL）、EP离心管（2mL）、烧杯（500mL）、培养皿（9

34、cm）、吸管、竹镊子、剪刀4、溶液或试剂： （1）0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液 （pH7.0）称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1 000ml。（2）0.15mol/L NaCl0.1mol/L EDTANa2溶液 （pH8.0）称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1 000ml。（3）5%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。

35、（4）氯仿异戊醇溶液按氯仿:异戊醇 = 24:1配制。（5）pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/L NaOH120mol/L TrisHCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。（6）6 mol/L NaCl 溶液称取34.8g NaCl，溶于约100ml蒸馏水中。（NaCl的饱和溶液）（7）95（V/V）乙醇 1 000ml。（8）75（V/V）乙醇 1 000ml。六、实验步骤【样品清洗】1、用烧杯（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。2、以新鲜鸡肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验前鸡应饥饿24h以上，以避免

36、糖原的干扰。称取约1g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。3、将洗净的组织剪成碎块。先加入2m1 0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆23次，使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液至5ml，转入离心管（10mL）。【去除核糖核酸蛋白】4、匀浆液在常温 6 000r/min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作23次，尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀。【蛋白质变性】5、将沉淀物悬浮于4倍体积的0.15 mol/L NaCl0.1 mol/L EDTANa2溶液中，搅匀，而后边搅拌边慢慢滴加5%