生物制药技术2基因构建

1、生物制药技术2016-3-71生物制药技术2基因构建生物制药技术（含实验）课程教学大纲教学内容理论课学时 绪论1 基因与工程细胞的构建3 工程细胞的发酵培养与蛋白表达2 重组蛋白的分离纯化2 生物制药的制剂研究1 生物制药的质量研究与分析技术4 生物制药的中试研究2 生物制药的稳定性研究1 生物制药的主要药效学研究1 生物制药的药代动力学研究1教学内容理论课学时小课讨论学时 生物制药的安全性评价3 第一次PBL生物制药立项 2 抗体药物3 基因治疗与基因药物2 肿瘤的细胞免疫治疗3 第二次PBL肿瘤的治疗 2 个体化医学诊疗2 生物制药的知识产权问题1 生物制药的药品注册2 第三次PBL生物制

2、药申报 22生物制药技术2基因构建生物制药研发的基本流程基因构建发酵培养分离纯化制剂研究质量研究中 试放 大稳定性研 究药效学研 究安全药理研 究临床申报药学(实验室)药学(中试)药理学临床试验3生物制药技术2基因构建2.1 基因与工程细胞构建2.2 工程细胞的发酵培养与蛋白表达2.3 重组蛋白的分离纯化2.4 生物制药的制剂研究2.5 生物制药的质量研究与分析技术2.6 生物制药的中试研究2.7 生物制药的稳定性研究第二章 重组蛋白药物的药学概论原核细胞真核细胞4生物制药技术2基因构建2.1.1 基本概念2.1.2 质粒、载体2.1.3 工程细胞与细胞库2.1.4 表达方式选择2.1.5 基

3、因构建与诱导表达2.1.6 实例2.1 基因与工程细胞构建第二章 重组蛋白药物的药学概论5生物制药技术2基因构建2.1 基因与工程细胞构建基因重组分子水平、提取、连接、转染、复制、表达别称基因工程、DNA重组、遗传工程、基因操作、克隆工程细胞的三要素基因载体宿主细胞2.1.1 基本概念6生物制药技术2基因构建基因一段具有蛋白结构编码的核酸序列载体质粒、噬菌体、病毒限制性内切酶、连接酶抗生素抗性基因Kan、Neo、Tet、Amp、Str宿主细胞细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞2.1 基因与工程细胞构建2.1.1 基本概念7生物制药技术2基因构建组建表达载体条件强启动子两侧的调控序列选择标记正确

4、的读码框架合适的核糖体结合位点（SD序列）SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离被翻译的蛋白性质与稳定性合适的宿主细胞2.1 基因与工程细胞构建SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16S rRNA3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译2.1.1 基本概念8生物制药技术2基因构建2.1.2 质粒、载体2.1 基因与工程细胞构建9生物制药技术2基因构建2.1 基因与工程细胞构建10生物制药技术2基因构建2.1 基因与工程细胞构建11生物制药

5、技术2基因构建克 隆鉴 定宿主细胞细胞筛选细胞库合成、分离、RT-PCR优化、测序抗性基因、限制性内切酶位点宿主与产品的相关性表达水平、产品鉴定三级细胞库、遗传稳定性载 体2.1 基因与工程细胞构建2.1.3 工程细胞与细胞库12生物制药技术2基因构建原始种子库主种子库工作种子库2.1 基因与工程细胞构建13生物制药技术2基因构建调控调控生物遗传中心法则DNA RNA Protein2.1 基因与工程细胞构建14生物制药技术2基因构建蛋白质结构Primary Structure The sequence of amino acids on the polypeptide chainSecond

6、ary Structure Conformation of the polypeptide chain (3D structure)Tertiary Structure Three Dimensional Structure (Folding) of the proteinQuaternary Structure Complexation with other proteins (Similar or dissimilar structures)2.1 基因与工程细胞构建2.1.4 表达方式选择15生物制药技术2基因构建依赖于制备过程的蛋白质结构Prokaryotic cells Easier

7、 to make Cheaper to produce Improper folding of protein No glycosylation No Secretion Eukaryotic cells Can properly fold the protein Glycosylate-(maybe differently) Harder to clone Harder to maintain in cell culture May harbor viruses Lower yields Higher expense2.1 基因与工程细胞构建2.1.4 表达方式选择16生物制药技术2基因构建

8、2.1.5 基因构建与诱导表达2.1 基因与工程细胞构建17生物制药技术2基因构建2.1 基因与工程细胞构建2.1.5 基因构建与诱导表达18生物制药技术2基因构建Soluble Inclusion BodySecreting2.1 基因与工程细胞构建原核细胞表达系统2.1.5 基因构建与诱导表达19生物制药技术2基因构建优点突出正确指导蛋白质正确折叠提供糖基化等多种翻译后加工在新基因发现、蛋白质结构功能研究中起极为重要的作用生产阶段系统表达水平达到7g/L生物医药产业发达国家新药研发中均选择哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统2.1.5 基因构建与诱导表达20生

9、物制药技术2基因构建正常细胞生长特性锚地依赖性血清依赖性接触抑制性形态依赖性体外培养正常细胞改变某些特征，越过生理临界点，继续无限制分裂细胞系形成2.1 基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统2.1.5 基因构建与诱导表达21生物制药技术2基因构建哺乳动物细胞表达系统受体细胞条件细胞系特征丧失细胞接触抑制和锚地依赖性遗传稳定性外源基因多次传代不丢失合适的标记便于筛选与维持生长快且齐分裂周期短，生长均一安全性不合成、分泌致病物质，不致癌以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞必须条件2.1 基因与工程细胞构建2.1.5 基因构建与诱导表达22生物制药技术2基因构建遗传标记遗传标记编码产物筛

10、选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPXGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA灭活Xyl-A哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建2.1.5 基因构建与诱导表达23生物制药技术2基因构建常用宿主细胞 商业化CHO中国仓鼠卵巢细胞系BHK小仓鼠肾细胞系COS非洲绿猴肾成纤维细胞系NSO小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系HEK293人胚肾细胞

11、系NIH313鼠成纤维细胞系因稳定性与糖基化不同，根据表达目的蛋白选择适当细胞系哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建2.1.5 基因构建与诱导表达24生物制药技术2基因构建真核表达载体必要原件高活性启动子、转录终止序列、有效mRNA翻译信号复制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位点标志基因内含子内部核糖体进入位点（IRES）哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞构建 一般真核mRNA的翻译都需要5帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5端具有一段较短的RNA序列（约150-250bp），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与

12、RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site, IRES）2.1.5 基因构建与诱导表达25生物制药技术2基因构建诱导的方式IPTG/乳糖低温pH低磷表达检测方式表达标志物电泳GFP遗传稳定性基因稳定性琼脂糖电泳、指纹图谱、PCR、测序表达稳定性表达标志物、活性四环素蜕皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1 基因与工程细胞构建2.1.5 基因构建与诱导表达26生物制药技术2基因构建高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因DHFR-MTX高效表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1 基因与工程细胞

13、构建2.1.5 基因构建与诱导表达27生物制药技术2基因构建组织纤溶酶原激活剂第一个重组哺乳动物细胞规模化生产的溶栓药物人组织纤溶酶原激活剂(tPA)目前市场上销售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞为CHO系统人tPA也可由大肠杆菌生产，但蛋白折叠效率低2.1 基因与工程细胞构建2.1.6 实例28生物制药技术2基因构建组织纤溶酶原激活剂2.1 基因与工程细胞构建2.1.6 实例29生物制药技术2基因构建代表药物优点缺点第一代链激酶（SK）尿激酶（UK）溶栓能力强缺乏特异性导致出血过敏反应第二代组织型纤溶酶原激活剂（tPA）具有溶栓特异性副作用较少半衰期短需大量注射第三代瑞替普酶（rPA）兰替普酶（NPA）溶栓快速治疗效率高半衰期长生产工艺复杂第四代PAI-1 抑制剂可以口服给药半衰期长价格低廉仍处于试验阶段未开发用于临床组织纤溶酶原激活剂2.1 基因与工程细胞构建2.1.6 实例30生物制药技术2基因构建tPArPA 527个氨基酸 分子量65kD缺失突变 355个氨基酸 分子量39kDKringle、丝氨酸蛋白酶区Finger区、Kringle、Kringle、EGF区、丝氨酸蛋白酶区2.1 基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂2.1.6 实例31生物制药技术2基因构建2.1 基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂2.