人类胚胎肌肉细胞体外自发恶性转化抑癌基因的改变

1、人类胚胎肌肉细胞体外自发恶性转化抑癌基因的改变【摘要】目的:研究人类胚胎肌肉源性自发恶性转化细胞系抑癌基因的改变方法：运用免疫组化、pr,pr产物直接测序研究该类细胞系抑癌基因p16,p15,tap(甲硫氨酸磷酸化酶)和p53基因及蛋白的改变结果：在染色体9p21处存在纯合性片段缺失，包括p16，p15及tap；对p53基因突变率高发的外显子7，8及内含子7测序发现存在范围较大的突变，外显子突变率高达13%，皆为点突变，而内含子变异更甚，包括小片段缺失、插入、移位及点突变，其几与正常p53序列无明显相似性，在测序的6个细胞系中含5个不同遗传背景突变序列具有高度一致性结论：多种抑癌基因的变异在正

2、常胚胎肌肉细胞自发恶性转化进程中具有重要的作用【关键词】恶性转化基因肿瘤抑制肉瘤染色体9p21p53基因突变0引言1材料和方法1.1细胞培养人类胚胎肌肉细胞原代培养和传代方法参考文献8在取材5个不同遗传背景胚胎肌肉进展培养47后自发恶性转化，并能稳定维持体外长期传代,至今恶性转化的细胞体外培养已达1-3a其中有2个细胞系来自同一个胚胎肌肉细胞的不同培养时期恶性转化，命名为s5b和s5.其它4个细胞系分别命名为s0812,s0504,s3,s4.s0812和s0504细胞系的性质在我们的前期研究中已经有报道81.2基因组dna的提取采用宝生物公司的universalgenidnaextratin

3、kitver.3.0takarabitehnlgy(dalian).,ltd.，按使用说明标准操作表1引物序列略1.4p53外显子78测序对6个胚胎自发恶性转化肌肉细胞系s0812,s0504,s3,s4,s5b,s5提取dna,扩增p53外显子7,8，pr产物送上海生工公司纯化后直接测序9，测序仪为abipris3730，测序染料为bigdyeterinatr1.5p16免疫组化将肿瘤细胞接种于35培养皿，待细胞贴壁饱和度80左右，弃去培养基，按单层贴壁细胞免疫组化实验步骤操作，一抗为20倍稀释的鼠抗p16ab北京中衫金桥生物技术，应用ae染色法进展显色后照相，阳性对照用人正常胚胎肌肉细胞2

4、结果2.1肿瘤细胞系9p21处片段缺失在个样本的pr扩增中都出现p16外显子1,2,3，p15外显子1及tap外显子4,5,6,7的纯合性缺失图1a-d而tap外显子2,3那么有模糊条带及非特异性扩增图未示，正常对照那么无非特异性扩增图1e，提示其可能在附近存在断裂位点图1肿瘤细胞系9p21处片段缺失略2.2p16免疫组化阳性对照正常胚胎肌肉细胞可见胞质泛染(图2a)，而肉瘤细胞系那么显示阴性(图2b).a：正常胚胎肌肉细胞阳性；b：肉瘤细胞系.图2p16免疫组化阴性s3细胞系略2.3p53外显子7,8及内含子7测序在对6个样本s0812,s0504,s3,s4,s5b,s5的p53外显子78

5、测序发现其外显子7与正常p53序列比对其同源性为92，外显子8为86左右，内含子7与正常p53序列比对局部几无明显相似性,予人工比对,其余局部可比对(图3)其中，外显子皆为点突变，内含子突变类型有点突变，缺失、插入3讨论p16蛋白能抑制ylind/dk4，阻止prb磷酸化，从而抑制细胞分裂进入s期，在多种肿瘤中可观察到其失活10-12我们通过对人胚胎肌肉细胞的长期培养，约47后其自发转化为恶性增殖细胞系8，pr及免疫组化结果均支持其存在缺失，而非单纯的点突变tap蛋白是嘌呤和甲硫氨酸合成补救途径中一个关键酶13，在人或鼠源的多种恶性细胞系和人多种肿瘤中有较高频率的纯合性缺失，多与p16缺失伴随

6、出现10文献报道在96个骨肉瘤组织中至少一个外显子缺失率的到达37.5%12我们对人胚胎肌肉恶性化细胞系体内研究发现该类细胞系表现肉瘤性质8pr扩增其tap外显子27结果显示47纯合性缺失p53蛋白在超过半数以上的不同肿瘤中存在突变，其中错义突变约占74%,高于其它抑癌基因发生的频率，从而导致其正常功能的失活及突变蛋白的产生14p53基因的突变在软组织肉瘤中很常见，特别是在转移组织及高度恶性化的类型中15而且，研究发现各种p53突变对肿瘤的恶性化程度、肉瘤患者的生存率等有显著的影响，即野生型p53功能的消失或抑制，突变型p53蛋白的获得性致癌才能会促进肿瘤的发生开展，降低患者生存率14所以，对

7、p53基因的研究有助于更好的说明细胞自发恶性化进程的分子机制而文献报道关于肉瘤p53基因的变异大多是点突变包括内含子16引起的蛋白编码改变，从而产生突变型p53蛋白现已在genbank数据库中确认的关于p53的snp位点很多,我们在6个细胞系5个不同遗传背景自发恶性化的12次测序结果双向测序显示，其外显子突变与现有确认的p53snp位点是不同的;内含子7更表现出极大的基因变异，其中包括小片段缺失及点突变，这与以往报道的p53内含子突变是完全不同的17，且12次测序结果具有高度一致性a:上序列为肿瘤细胞系(6个细胞系测序序列一样)序列,下序列为正常人p53外显子7;b：测序p53内含子7上半局部

8、序列,因其在genbank数据库比对后示无明显相似序列,予人工比对;:测序p53内含子7下半局部序列,使用blast比对;d:测序p53外显子8.图3测序结果略综上研究结果，我们初步发如今人类胚胎肌肉自发恶性转化细胞系中一些抑癌基因的改变：9p21处存在片段缺失，其中包括p16、p15及tap其缺失导致周期蛋白抑制功能的丧失，在基因程度上为肿瘤细胞失控的分裂增殖才能解除了限制，分裂才能的增强将加速基因突变频率及癌基因的累积p53抑癌基因在外显子7、8的点突变及内含子的大范围改变，将肯定影响p53蛋白的转录及表达14,18,3.6个自发恶性化细胞系结果完全一致，提示其突变形式具有强大的选择优势然

9、而，我们对胚胎肌肉来源的自发恶性转化肉瘤细胞系dki家族及p53基因的研究还只局限在基因组程度，且还有其他突变率较高的区域未予明确故接下来仍须在dki家族及p53通路等方面进展更深化的研究相信随着对自发恶性化肉瘤细胞系抑癌基因的深化研究，将有助于更好的解释人正常胚胎肌肉细胞自发恶性化进程的关键分子学机制，为寻找新的基因治疗途径提供帮助【参考文献】1iankg.theretinblastagene:rleinellylentrlandelldifferentiatinj.fasebj,1993,7(10):841-845.3xu,qianh,zhu,etal.anvelturelllinelnedfrutatedhuanebrynibnearresenhyalsteellsj.nlrep,2022,12(3):501-508.4asak,yasu,hesed,etal.auulatedhrsalinstabilityinurinebnearresenhyalsteellsleadstalignanttransfratinj.steells,2022,24(4):1095-1