《基因工程概论》课件chapt6

1、基因工程概论第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的提取和检测第二节 DNA切割、连接与细胞转化第三节 DNA聚合酶链式反应第四节 Southern杂交技术第五节 DNA的序列分析第六节 植物转基因技术质粒DNA的小量制备 将含有质粒DNA的大肠杆菌接种到LB培养基中（含有相应抗生素），在37下震荡培养过夜，这样质粒DNA便随着细菌的繁殖而得到了大量的扩增。当细菌培养物生长到对数晚期时，我们就可获得很高产量的质粒DNA。通过离心收集细菌，用碱性溶液处理使得细菌细胞

2、裂解，释放出其中的质粒DNA分子。在碱性条件下，宿主的线状染色体DNA发生变性，但是闭环质粒DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开，所以当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确复位成为超螺旋分子。通过离心去掉细胞碎片、染色体DNA和其它杂质，并将水相的质粒DNA用乙醇沉淀出来，最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。SDS法小量制备植物基因组DNA的原理 在含有去污剂，如SDS或CTAB的溶液中，植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组DNA，通过氯仿/异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质，这时的基因组DNA分配在水相中。 然后用乙醇(或异丙醇)将水相的DNA分子沉淀出

3、来，最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。剪取新鲜的植物叶片约20mg，剪碎置于1.5ml离心管中；向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片；在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片；立即加入300uL 65预热的提取液摇匀，于65水浴约1hr，其间摇动数次；加等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀，于12000 rpm离心5分；转移上清液到另一干净1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置2min，14000rpm离心5min；倾去上清液并用200uL预冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀，14000rpm离心5min；用枪头小心吸去乙醇，自然风干DNA后溶于50uL ddH2O中，置-20保

4、存备用。植物基因组DNA的小量快速制备方案 DNA提取液的配方Ingredient of the genomic DNA extracting solution成 分Ingredient工作浓度working concentrationTrisCl（pH8.0）100mMEDTA（pH8.0）5mMNaCl500mMSDS1.25%PVP1%DNA的凝胶电泳检测 通常，琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺 (polyacrylamide)凝胶被用于核酸的分离研究、鉴定和纯化DNA分子。也可以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。在电场当中，带电分子会以一定的速度移向相应的电极，而且其迁移速度同电场的

5、强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，同分子的摩擦系数成反比的。所以，通过电泳就可以利用分子大小、构型、形状以及所带净电荷的不同而将混合物中的各成分分离。在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态。所以，在电场中核酸分子向正极泳动。在特定电场强度下，DNA分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。 溴化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)是一种核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现凝胶中的核酸分子。在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DN

6、A谱带。安全警示：EB是一种强的DNA诱变剂，使用时尽量避免触及皮肤。电泳时有时使用到较高的电压，要小心触电。DNA的凝胶电泳检测 琼脂糖 是一种线性多糖，从红色海藻琼脂中提取的良好电泳介质，其密度由琼脂糖的浓度决定。化学修饰的低熔点(LMP)琼脂糖，因此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段回收制备电泳。聚丙烯酰胺凝胶 过硫酸胺与TEMED (N、N、N、N-四甲基乙二胺) 是单体丙烯酰胺的催化剂和诱变剂，它们使单体丙烯酰胺聚合成长链，长链与长链间就交联成凝胶，链长和交联的程度就决定了凝胶的孔径，同时也决定了分离DNA的能力。DNA的凝胶电泳检测 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 +-仪器 电泳

7、仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；药品 Agarose、 loading buffer、 TAE buffer、 EB（溴化乙锭）;上样缓冲液（6X）配方 0.25% 溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、 40%蔗糖；水溶液4保存。琼脂糖and聚丙烯酰胺凝胶电泳 豆粕DNA质粒DNA第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的提取和检测第二节 DNA切割、连接与细胞转化第三节 DNA聚合酶链式反应第四节 Southern杂交技术第五节 DNA的序列分析第六节 植物转基因技术第二节 DNA切割、连接与细胞转化DNA分子的酶切与凝胶电泳分离电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.

8、0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTTDNA分子的酶切与凝胶电泳分离DNA分子的连接POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口载体自连或产生二具体等DNA分子的连接与细菌转化大肠杆菌感受态细胞（competent cell）的制备在不含抗生素的LB平板上涂布大肠杆菌DH5，于37培养过夜(16-20h)；挑一个单菌落接种于25mL无菌的LB 培养液中, 37中速震荡培养3h；将上述菌液冰浴5分钟,然后在4 ,400

9、0rpm 离心10分钟;将细菌沉淀用5mL 预冷的CaCl2（0.1M）重悬，冰浴一会后于4 4000rpm离心10分钟；将细菌沉淀用1mL 预冷的CaCl2（0.1M）重悬，取200uL用于细菌转化,其余菌液加入20%的无菌甘油,摇匀后于-20保存备用; 转化CK-重组菌落CK+DNA分子的连接与细菌转化质粒DNA转化大肠杆菌的程序用冷的无菌枪头吸取200uL感受态细胞到一新的离心管中,加入质粒DNA后冰浴30分钟；立即将转化用的离心管置入42水浴中静置90秒；迅速将离心管移入冰水混合物中冰浴1-2分钟;加入800uL的LB培养基,混匀后于37水浴5分钟；将离心管侧向固定在摇床上,37缓慢震

10、荡培养45分钟;于室温1000rpm离心5分钟,弃取约800uL的培养液,再将剩余的培养液和细菌重悬,然后涂布到含有抗生素的LB平板上37选择培养过夜(16h);检测选择平板上的抗性菌落, 并提取质粒DNA进行鉴定. DNA片段的回收与纯化 1、用干净的刀片将单一目标DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，尽量切除多余的凝胶，放入1.5ml离心管中，称取重量。2、加3倍体积的溶胶缓冲液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100l，则加入300l溶胶液。如凝胶更大，可按比例加大溶胶液用量），56水浴10min，不断温和上下翻转离心管，确保胶块溶解，如果还有未溶解的胶块，可再加入部分溶胶缓冲液或继续放置

11、几分钟，以使胶块溶解。3、取一个新的离心吸附柱，放入2ml废液收集管中，将上一步所得溶液加入离心管吸附柱，12000rpm离心30s-60s，倒掉废液收集管中的废液。4、在离心吸附柱中加入700l漂洗液，12000rpm离心30s-60s，弃掉收集管中的废液。5、在离心吸附柱中加入500l漂洗液，12000rpm离心30s，弃掉废液收集管中的废液，如果样品中杂质蛋白及盐类较多可多重复一次。6、12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，然后可在37温箱中烘烤10min，使酒精彻底挥发。7、取出离心吸附柱，放入一个干净的离心管中，加入适量的65-70水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置2-5min，

12、12000rpm离心1min，如要想得到更多的DNA，可将所得的溶液重新加入离心吸附柱，重复此步操作。8、取1-3l得到的溶液，琼脂糖凝胶电泳检测浓度与纯度。第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的提取和检测第二节 DNA切割、连接与细胞转化第三节 DNA聚合酶链式反应第四节 Southern杂交技术第五节 DNA的序列分析第六节 植物转基因技术第三节 DNA聚合酶链式反应The polymerase chain reaction (PCR) is an enzymatic synthesis approach to DNA. It allows the rapid manufacture

13、of large quantities of specific DNA sequences without the need for cloning in E. coli, growth of the bacteria and isolation of the DNA. The reaction can take place on just one single molecule of target DNA and has found application in many areas of science, from DNA cloning and sequencing to Forensi

14、c science and biosystematics. PCR技术是一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系中，加入DNA模板，dNTPs, 引物和DNA聚合酶，然后通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使得目标DNA得到快速大量的复制。 PCR技术已经广泛应用于科学研究和医疗事业，比如DNA的克隆，序列分析，医学诊断以及生物系统发生科学的研究等。 反应需要两条合成的寡核苷酸片段和耐热的DNA聚合酶。一般用Taq DNA聚合酶，是从栖热水生菌（Thermus aquaticus ）中提取出来的。 两条引物分别和正义链和反义链的 3 端结合，然后朝着彼此的3

15、-OH 方向延伸。Polymerase Chain Reaction（PCR） The reaction requires two synthetic oligonucleotide primers and a thermostable DNA polymerase. The latter is usually the thermostable DNA polymerase from the thermophile, Thermus aquaticus, known as Taq. The primers are chosen to match the 3 end of the sense s

16、trand of the target sequence, and the 3 end of the antisense strand. This means that they will have their 3-OH groups oriented towards each other. Polymerase Chain Reaction（PCR） Polymerase Chain Reaction（PCR） 947256 反应的第一步是加热 DNA 到95C 进行变性（denature） 使双链解离为单链，解除变性条件后在较低的温度50C下引物退火（annealed）结合到目标序列上，然

17、后在72C下， 在dNTPs存在的情况下， DNA 聚合酶运用使引物序列延伸（ extends ） 。热稳定的酶不仅可以使DNA快速合成, 而且在较宽的温度范围内都能催化DNA合成。 三个步骤：变性, 退火 和 延伸 PCR循环: 一般 25-40 个循环. 每个循环都使目标序列翻倍从而PCR可以快速扩增Polymerase Chain Reaction（PCR） 947256 The first step of the reaction is to heat the DNA to around 95C to denature it and separate the two strands.

18、The primers are annealed to their target sequences at a lower temperature, usually around 50C and the DNA polymerase then extends the primer sequence using dNTPs at 72C. The thermostable enzyme not only allows fast DNA synthesis, but can withstand the temperatures used to denature the DNA. These thr

19、ee steps：denaturation, annealing and extension form a PCR cycle: A typical amplification will have around 25-40 cycles. Each cycle will double the amount of the target sequence resulting in a very rapid amplification:Polymerase Chain Reaction（PCR） PCR 扩增过程中片段增殖的计算 随着扩增循环数的增加，长链目标片段增加的值为 2(n+1), 而短链目

20、标片段则以几何倍数增加值为 2(n+1) 2(n+1)。 20个循环后, 目标片段大约增加 1 百万倍。 PCR 扩增过程中片段增殖的计算 The amplification cycles increase the number of long strands arithmetically 2(n+1), whereas the short target sequences increase exponentially 2(n+1) 2(n+1). After 20 cycles, the target sequence has been amplified over 1 million-fo

21、ld. PCR 使用的引物需特异性与目标序列匹配， 如果引物与DNA分子的其他部位结合, 非特异扩增将产生。 引物与目标序列的特异性结合取决于温度, 每对引物最适的温度要通过实验获得。 寡核苷酸引物的长度一般为 20-25 个碱基，GC 含量一般为 50% 左右，这样退火温度在52-58C之间。很长的寡核苷酸引物或高的GC含量 需要很高的温度，而短的寡核苷酸引物或低的GC含量则需要较低的温度。对于 17-25 个碱基的引物, Tm的计算为: 最适的退火温度一般比 Tm低3-5C。 Primer design and cycle optimization The primers used in

22、PCR need to be specific to the target sequence. If the primers anneal to other parts of the DNA molecule, then non-specific templates will be synthesised and compete with the desired target sequence in the amplification. The specificity of primer annealing is primarily determined by temperature, and

23、 the optimum temperature for any given pair of primers is determined experimentally. Oligonucleotide primers of around 20-25 bases long with a %GC content of around 50% will specifically anneal at 52-58C. Longer oligonucleotides or higher GC content will need higher temperatures, whilst shorter olig

24、onucleotides and lower GC contents need lower temperatures. For an oligonucleotide 17-25 bases long, the melting temperature is given by: The optimum annealing temperature is usually 3-5C below the melting temperature. Primer design and cycle optimization 1、所设计引物长度范围为18-27碱基，最长不超过38，因为过长会导致延伸温度大于74，

25、不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 2、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则会容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发率增加。引物退火温度在50-70之间，上下引物之间退火温度相差不超过5。 3、GC含量在40-60%之间，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4、3末端最好不是A，3末端为A的错配效率明显高于其它三个碱基。引物设计原则PCR反应体系的确立WaterBuffer（10）Mg+（25mM）dNTPs（10mM）Primer1（10uM）Primer2（10uM）Taq（5U/uL）Te

26、mplets12.821.60.4110.21128201641010220uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量PCR扩增程序举例Tem.9494567272Time00:08:0000:00:3000:00:4000:01:0000:07:00Cycles35PCR反应的应用 广泛应用于科研和实际检测中，用于DNA 研究、序列分析、基因表达测定、从cDNA库放大特定克隆、构建基因图、进化分析、生物证据分析、医学研究与临床检验、性别控制、转基因生物检测等。PCR扩增结果分析举例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3

27、-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的提取和检测第二节 DNA切割、连接与细胞转化第三节 DNA聚合酶链式反应第四节 Southern杂交技术第五节 DNA的序列分析第六节 植物转基因技术第四节 Southern杂交技术 杂交原理：在特定的条件下，含有互补序列的两条核苷酸单链或是单链DNA与RNA可以通过碱基互补配对而变成双链结构，即生成较为稳定的DNA/DNA或DNA/RNA杂种分子。所以，可以利用被标记的一段核苷酸序列作为探针来分析被检测DNA中

28、是否含有和探针同源的目标序列。 凝胶电泳分离：多数核酸杂交试验中，都先要将经凝胶电泳分离的DNA或RNA分子转移到滤漠上，然后再进行杂交分析。常用的滤膜有尼龙滤膜和硝酸纤维素滤膜等。 核酸印迹转移(Nucleic acid blotting)：将核酸样品转移到固定支持物滤膜上则称核酸印迹转移法，常见的有电泳凝胶核酸印迹转移法和菌落或噬菌斑印迹法等。转膜 采用毛细管洗脱法将RNA自凝胶转移至尼龙膜。操作步骤如下：1、以玻璃板作平台，放在托盘上，滤纸用10 SSC蘸湿后平铺在玻璃板上，往托盘中加入10 SSC，使液面稍低于平台表面，滤纸润湿后，用玻璃棒赶出滤纸与玻璃板间的气泡。2、用l0 SSC浸

29、泡凝胶30min，把浸泡好的凝胶翻转置于平台上湿润的滤纸中央。3、在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，赶出滤膜与凝胶之间的气泡。4、用DEPC水浸湿与凝胶同样大小的滤纸，湿润的滤纸放置在湿润的尼龙膜上方，赶出其间滞留的气泡，上面再放置3层同样大小的滤纸。5、切一叠稍小于滤纸的吸水纸，将其放置在滤纸的上方，并在吸水纸的上方放一块玻璃板，然后用500g的重物压实。6、使上述RNA转移持续48h，纸巾浸湿后，及时更换新的纸巾。7、转移结束后，在尼龙膜上用铅笔标记凝胶加样孔及加样的顺序。8、将尼龙膜放在两层滤纸中间，80烘烤2h，室温保存尼龙膜待用。预杂交 1、配置预杂交液：于50ml大离心管中分别加入9ml

30、 ddH2O、3ml 5 HSB、1.5ml Denhardts，混匀后置65水浴。2、Carrier DNA（鲑精DNA：10mg/ml）变性：将盛有Carrier DNA的离心管放入沸水中煮7min，变性后迅速放于冰浴中。3、待50ml大离心管中的预杂交液澄清后，加入500l变性后的Carrier DNA，混匀后倒入杂交管中。4、杂交膜用2 SSC润湿，正面朝里，反面接触管壁，放入杂交管中，使预杂交液浸润杂交膜。盖好盖子后置于65温箱中，振荡预杂交56h（新膜）或2h（旧膜）。标记探针1、离心管中加25ng探针，补充ddH2O到15l后在沸水浴7 min，变性后迅速放于冰浴中。2、依次加入

31、5l 5 OLB，2l牛血清蛋白（BSA），1l Klenow酶（5U/l），稍微离心后，混匀。加入2l-32PdCTP，小心地用枪头吸几次，混匀。3、37，温育2h。4、标记好的探针中加入等体积的1 TE（25l），1/10体积的3mol/L的NaOH（5l），混匀后变性5min。5、加入500l的预杂交液。杂交、洗膜和放射自显影杂交：将标记好的探针，加入到已充分与膜预杂交好的预杂交液中，混匀，65，杂交过夜。洗膜和放射自显影：1、用42的洗脱液（2 SSC，0.5% SDS）和洗脱液（0.2 SSC，0.5% SDS）分别洗脱1-2次，每次15min。2、洗膜后用滤纸将膜吸干，然后用保鲜膜

32、包好，注意除去气泡。放至于磷屏（BIO-RAD）中，曝光2-5天后，用磷屏仪扫描。第四节 Southern杂交技术Southern DNA印迹杂交X显像图片检测重组体克隆的菌落杂交技术第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的提取和检测第二节 DNA切割、连接与细胞转化第三节 DNA聚合酶链式反应第四节 Southern杂交技术第五节 DNA的序列分析第六节 植物转基因技术双脱氧末端终止法DNA序列分析的原理 在用DNA聚合酶复制核苷酸链时，如果在反应物中加入一定量的某一种2，3-双脱氧核苷酸, 如ddTTP，就会在应当掺入dT的位置掺入ddT。由于ddT核苷酸的3碳原子不含有羟基而不能和下一

33、个核苷酸的5碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键，所以DNA链就不能继续向后延伸。 Sanger据上述原理设计了DNA测序的末端终止法。测序时要进行4个独立的反应，每个反应中有一种ddNTP用32P标记，并且在4个反应中分别加入一定比例的dATP, dTTP, dGTP和dCTP。 这样反应一段时间后，每个反应中都会生成一系列由对应的那种ddNTP结尾的长短不一的DNA片段，而且这些片段的5端序列是相同的。最后，将反应物变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经放射自显影后就可以读出DNA的碱基顺序。535A G C TATCAGCGAAT末端终止法DNA序列的分析原理示意图第六章 基因工程的基本技术第

34、一节 DNA的提取和检测第二节 DNA切割、连接与细胞转化第三节 DNA聚合酶链式反应第四节 Southern杂交技术第五节 DNA的序列分析第六节 植物转基因技术第六节 植物转基因技术1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定作物转基因育种的发展优势扩大了作物育种的基因库 转基因育种打破了常规育种的物种界限，来源于动植物和微生物的有用基因都可以导入作物，培育成具有某些特殊性状的新型作物品种。提高了作物育种的效率 缩短育种年限，单一性状改良减轻了农业生产对环境的污染 可以减少化学杀虫剂对棉农及天敌的伤害，大幅度降低用于购买农药和虫害防治的费用。另外，

35、农用化肥的利用率将极大地提高，这对于有效减少农田土壤中的化肥污染具有积极的意义。拓宽了作物生产的范畴 转基因作物提供的农产品范围得到了极大的拓宽，各种有价值的蛋白产品都可以利用植物反应器进行高效生产，番茄、马铃薯、莴苣和香蕉等作物已被成功用于生产口服疫苗。另外，转基因作物还可以用来生产各种工业原料，比如纤维素、海藻糖和可降解塑料等。农杆菌介导法基因枪法植物转基因技术花粉管通道法其它方法优点：低成本易操作、转基因的拷贝数低、导入片段的确定性好。缺点：受作物基因型的影响较大优点：低成本易操作、不受基因型影响、不需要经过组织培养可以获得转基因种子。缺点：导入片段的确定性差、转化效率很低。优点：不受作

36、物基因型的限制。缺点：成本高、转基因的拷贝数高、导入片段的确定性差聚乙二醇法、显微注射法、激光介导法、脂质体介导法农杆菌介导法植物转基因的原理Agrobacterium-mediated plant transformation基因枪法植物转基因的原理Plant transformation via microprojectal bombardment第四节 植物转基因技术1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定pCAMBIA1301质粒T-Border(right)Nos 3Gus35S5NcoI35S5Hyg(R)T-Border(left)3

37、5S3HinDIIISalIBamHIEcoRIBstEIIpCAMBIA130111837bpLac ZpCAMBIA1301pBS-RSP1/235SHyg(R)T3 PGusRSP2LacZNcoIpCAM-GusBam HIHind IIIKpnIBam HIKpnIHyg(R)T7 PGusRSP1KpnIBamHIGusNos3pCAM-RSP1/2-GusHyg(R)35S35S35SRSP2RSP1KpnI用KpnI和BamHI双酶切后连接BamHINos3Nos3LBRB(1715 bp)First intron(1182 bp)LBLBRBRB水稻蔗糖合酶基因启动子驱动Gu

38、s基因的表达载体构建第四节 植物转基因技术1、植物转基因技术的发展2、植物表达载体的构建3、植物转基因的过程4、转基因植株的鉴定基因枪轰击子弹的制取 1、称20mg（0.02g）PVP放入一干燥洁净的1.5ml离心管内，加入1ml无水乙醇，使其溶解，浓度为20mg/ml的母液。 吸出12.5l母液，稀释至5 ml，使其终浓度为0.05mg/ ml。3、称2.mg 1M金粉，放入一干燥洁净的1.5ml离心管内用1ml无水乙醇进行3次清洗（涡旋，短暂离心，吸出。注意：此时有少量金粉被粘在管壁上）。加入100l 0.05mol/L 亚精胺，涡旋混匀，超声波处理510s（去除电荷）。5、加入5l质粒D

39、NA（2g/l）混匀。边涡旋边加入100l 1mol/L CaCl2，室温静置10min。6、用1ml乙醇清洗5次，方法同上。7、用3ml 0.05mg/ml PVP将金粉稀释在一个10ml的大离心管中。8、打开N2总阀，调整减压阀，使N2压力在0.4左右，用纯度为99.997% N2干燥管15min。停止N2气流，然后切割管，使其长于平台10cm。9、将切割的管的一端与注射器相连，涡旋金粒子溶液并迅速将该溶液转入该切割的管，使其每一末端均留有6cm的空隙。10、迅速将上步盛有溶液的管置于支持物上并使溶液在管中停留3min，标记其充满的位置。用注射器缓慢移动溶液刚好经过右侧标记。使管旋转180，将溶液全部倒出。11、使管旋转30s，打开N2在0.350.4rpm，旋