《基因工程概论》课件Chapt2

1、基因工程概论基因工程概论第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第二章 基因操作的工具酶基因工程的工具酶(instrumental enzyme of gene engineering):是应用于基因工程的各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取和重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。能够将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶称为核酸酶。核酸酶的分类：第二章 基因操作的工具酶1、根据核酸底物分：（1）RNA酶（RNase）：作用底物是RNA；（2）DNA酶（DNase）：作用底物是D

2、NA；（3）底物非专一性核酸酶：底物可以是DNA也可以是RNA。第二章 基因操作的工具酶2、根据对底物作用方式分：（1）核酸内切酶（endonuclease）：从核酸内部切割磷酸二酯键；（2）核酸外切酶（exonuclease）：从核酸分子末端开始一个一个切割核苷酸；（3）少数核酸酶：既能够内切又能够外切。第二章 基因操作的工具酶3、根据对底物碱基专一性分：（1）碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）；（2）碱基非专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随意）。第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶

3、Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类和命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶及其应用50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象(B)(K)大肠杆菌B大肠杆菌K11410 410 4E.O.P 成斑率efficiency of pla

4、ting限制修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核 酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类和命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念 限制性核酸内切酶（ Restriction endonuclease

5、s）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300种微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶的分类1. 限制修饰活性2. 内切酶的蛋白 质结构3. 限制辅助因子4. 切割位点5. 特异性切割6. 基因克隆中 I 型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用 II 型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用 III 型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3端24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名

6、的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为 Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则 用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。*星号活性(star activity):也称星活性，同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，例如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、反应液中Mg2+被Mn2+代替、有机溶剂影响时等，酶切割位点

7、专一性发生改变。这个特性称为星号活性。在这些酶制剂的包装和产品说明书上注明（*），以表示区别，提示使用者注意。1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类和命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶的3大特点1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别 位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序 列（靶序列）。2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性 双链DNA被酶切后，分布在两 条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平 末端的D

8、NA分子）。Sma I CCCGGG GGGCCCEcoR I GAATTC CTTAAGEcoR I5-G AATTC-33-CTTAA G-5Sma I5-CCC GGG-33-GGG CCC-5粘性末端平末端与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形 成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很 容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平 末 端 Blunt end 因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐 的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同裂酶 isoschizomers 能识别和切割

9、同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一 类限制性核酸内切酶。注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶 消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的 任一种所识别。几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5BamH I5 XXXXG GATCCXX

10、XXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5Bgl II5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 55 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 55 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5BamH IBgl II 推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶切位点

11、就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现频率并不均等。识别位点在DNA分子上出现的频率1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类和命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶 一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37）下，20L反应体系中1h完全降解1 g DNA所需要的酶量。影响酶活性的因素很多，最重要的有：A。DNA的纯度和甲基化程度B。甘油的含量（不超过5%）C。反应体

12、系中的离子强度D。反应体系的pH值E。反应的温度条件 （通常为37 ）酶单位的定义和影响酶活性的因素Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 酶 切 反 应 的 基 本 步 骤电泳紫外分析37 1h加反应液CKMBuffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 1.0kb1.0kb0.4kb0.5kb0.6kbCKMTT第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应

13、用第四节 修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、DNA连接酶作用的特点2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用DNA连接酶的发现 环形DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种Nick的酶存在。 1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条 DNA链之间形成磷酸二酯键的

14、酶DNA连接酶（ligase）。DNA连接酶 由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子；T4DNA连接酶 由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。（1970年） 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端DNA分子，所 以在基因克隆中应用广泛。NickNickDNA连接酶的性质大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子质量为75kD的多肽链。它对胰蛋白酶敏感，可被其水解。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中有300个分子，主要功能就是在DNA聚合酶催化聚合，添满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用。T4 DNA连接酶分子是一条分子

15、质量约为60kD的多肽链，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。 T4 DNA连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA黏性末端。DNA连接酶作用的特点A. 连接的两条链必须分别具有 3端自由羟基（-OH） 和5 端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼 此相邻时才能进行连接反应；B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过 程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有 两种能量分子，即ATP和NAD+。OKNO载体去磷防止自连的应用示例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接酶连接酶连接酶碱性磷酸酶2Pi寄主修复缺口载体自连

16、或产生二聚体等1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用DNA连接反应的条件 连接反应最佳温度为37，但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如，EcoRI 粘性末端连接部位只有4个碱基对，很容易断开。所以通常在4-15连接。影响连接效率的因素有：A. 温度（最主要的因素）B. ATP的浓度( 10M - 1M )C. 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）D. 反应时间（通常连接过夜）E. 插入片段和载体片段 的摩尔比转化4 过夜加反应液CK-重组菌落CK+DNA连接反应阳性对照：阳性对照为经测序确认含有相同大小插

17、入片段的重组菌落。确定连接产物已经转化到感受态细胞中。将感受态细胞进行铺板。阴性对照：阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落。仅将感受态细胞进行铺板，涂布的是没有转质粒的空菌。 这么做的目的是：如果最后阴性对照的盘子都有菌落生长了，那这批结果必然不可信；如果阳性对照长而目的盘子没长，那就说明是转化手法出了问题；如果阳性对照都没长，那就说明这批感受态细胞有问题。转化4 过夜加反应液CK-重组菌落CK+1、DNA连接酶作用的机理2、DNA连接酶的反应条件3、DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用粘性末端DNA片段的连接NickNick平末端DNA片段的末端加尾连接法33553355

18、末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶平末端DNA片段加接头连接法 衔接物(linker)，也叫接头，是由人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4连接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoR ICCGAATTCGGGGCTT

19、AAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4 DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节 DNA聚合酶及其应用

20、大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质 纯化的DNA pol I由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，分子质量为109kD。每个大肠杆菌细胞中含有400个分子，在37条件下每分钟能催化667个核苷酸掺入正在生长的DNA链。 DNA pol I在空间结构上近似球体，直径约65（1=10-10m）。在酶的纵轴上有一个约20的深沟（cleft），带有正电荷，这是该酶的活性中心位置。 大肠杆菌DNA聚合酶I （E.Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E.Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：5- 3聚合酶活性 以双链DNA为

21、模板，催化单核苷酸结合到引物的3末端，并不断延伸。5- 3外切酶活性 将双链DNA中游离的5末端逐个切去。3 - 5外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3端降解。不过对于双链的降解可被5-3的多聚活性所抑制。5 CCG3 GGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ATAGCCT5 CCGATAGCCT3 GGCTATCGGA5 CCGATAGCCT3 GGCTACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPol I + Mg2+T 大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途A. 制备高比活度的DNA探针 利用其5-3的外切

22、酶活性及其聚合酶活性。B. 用于DNA连接后的大缺口填充 利用5-3的聚合酶活性。C. 用于DNA的序列分析 利用5-3的聚合酶活性。 大肠杆菌聚合酶I的应用示例CCGATAGCCTGGCTATCGGACCGATAGCCTGGCTATCGGAPol I + Mg2+缺口转移(Nick translation)CCGGGCTATCGGACCGGGCTATCGGAPol I + Mg2+ATAGCCT缺口转移 (Nick translation)1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4 DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节 DNA聚合酶及其应用 Klenow片段的主要用途Kle

23、now片段大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段（76kD）酶分子，它仍然有53的聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性，但失去了53的外切酶活性。Klenow片段的主要用途修补限制性酶消化DNA形成的3隐蔽末端标记DNA片段的末端cDNA克隆中第二链cDNA的合成DNA序列的测定GAACTTAA1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4 DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节 DNA聚合酶及其应用 T4DNA聚合酶的特点T4DNA聚合酶是 从T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，它和Klenow片段相似，也是一条多肽链，分子质量亦相近，但氨基酸组成不同，它

24、至少含有15个半胱氨酸残基，也一样具有53的聚合酶活性和3 5的核酸外切酶活性。其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高200倍。特别是，T4DNA聚合酶还有第三种活力取代反应：如果反应体系中仅存在一种dNTP，这时T4DNA聚合酶就会表现出3 5外切酶活力，从双链DNA的3开始降解，直到露出和该dNTP互补的碱基为止，然后就在此位置发生合成和取代反应。CGTCGCGCAGCGCGTGCAGCGT4DNA聚合酶Mg+CGGCAGCGdTTPMg+ T4DNA聚合酶的用途1、以填充反应标记有5端延伸的双链 DNA片段2、以取代反应标记延伸末端或平头末端 的双链DNA片段3、用于DNA序列分析

25、1、大肠杆菌DNA聚合酶I2、Klenow片段3、T4 DNA聚合酶4、逆转录酶（反转录酶）第三节 DNA聚合酶及其应用 逆转录酶Reverse transcriptase逆转录酶是 一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种RNA依赖的DNA聚合酶。逆转录酶首先是1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。这两个课题组的论文都发在了同一期的Nature杂志上。主要用途是 将mRNA转录成cDNA以制备基因片段。3 AAAAAAAA AAAAAAAA5 TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5 TTT

26、TTTTTT3 AAAAAAAA 真核生物的DNA聚合酶真核生物中DNA 的复制依靠DNA聚合酶，它有不同的形式（、），此外还有多种蛋白质分子的参与。真核生物中DNA 聚合酶都没有53或3 5外切酶活性，聚合机制同原核生物的聚合一样。 DNA聚合酶中主要的酶（占总量的80%-90%）是DNA聚合酶，分子质量300kD，含有4或5个亚基，主要负责染色体DNA的复制。 DNA聚合酶分子质量45kD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA。聚合酶分子质量140kD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节

27、DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶Genetic engineering is largely an exercise in carefully controlled enzymology. A variety of enzymes form the basic toolkit of the genetic engineer. 1、末端脱氧核苷酸转移酶（terminal transferase）2、 SI核酸酶（SI nuclease）4、碱性磷酸化酶第四节 修饰性工具酶末端转移酶的特性末端脱氧核苷酸转移酶简称末端转移酶,是一类不依赖于DNA模板的DNA聚合酶。该类酶可以在没有模板链存在

28、的情况下，将核苷酸连接到DNA的在3羟基，特别是对于平末端的双链DNA末端加尾十分有效。最常见的用途是在酶切产生的平末端(载体和目的基因)加尾以便于创造粘性的互补末端。 Characters of the polymerase Terminal transferase is the common name of template-independant DNA polymerase. This enzyme is isolated from calf thymus and can add nucleotides to 3 hydroxyl groups of DNA without the n

29、eed for a template. The best primer is double stranded DNA (dsDNA) with blunt ends. Purine bases require magnesium ions and pyrimidine bases require cobalt ions. The enzyme builds up homopolymer chains if supplied with appropriate dNTPs. The most common use for this enzyme is the generation of compl

30、ementary tails on DNA fragments and vectors cut with restriction enzymes which generate blunt ends.平末端DNA片段的末端加尾连接法33553355末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP33553355AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶1、末端转移酶（terminal transferase）2、 SI核酸酶（SI nuclease）3、碱性磷酸化酶（Alkaline phosphatase）第四节 修饰性工具酶 SI核酸酶的特性 这是一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离的可以降解单链DNA或RNA的外切酶。其主要用途有：A、在cDNA合成过程中，切开cDNA的发夹末端；B、载体构建过程中，切去DNA片段的单链尾巴， 形成平末端结构。3 AAAAAAAA AAAAAAAA5 TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5 TTTTTTTTT3 AAAAAAAA 发夹结构的切除TTAAAATT单链尾巴的切除1、末端转移酶（terminal transferase）2、核酸酶SI（SI nuclease）3、碱性磷酸化酶第四节