糖尿病基因诊断和治疗

1、糖尿病基因诊断和治疗一.糖尿病的临床表现二.辅助检查三.糖尿病的基因诊断一.糖尿病的临床表现:典型者有“三多一少病症，即多饮、多尿、多食、消瘦，不少患者缺乏典型临床病症，表现为反响性低血糖，或某些急慢性并发症的病症。可疑指征有多尿，多食病症者有原因不明的体重下降，特别是原来超重或肥胖者肥胖或者超重者有糖尿病家族史，年龄大于40岁者皮肤瘙痒，反复出现疖肿或者皮肤溃疡经久不愈者有一过性高血糖史或尿糖阳性史者有反响性低血糖发作史者视力下降者有巨大儿出生体重=4kg分娩史的女性或男性阳痿二.辅助检查血糖的测定口服葡萄糖耐量试验 OGTT空腹血浆或血清胰岛素及C肽测定胰岛素或C肽释放试验糖基化血红蛋白测

2、定糖化血清蛋白测定自身抗体测定其他检查1999年WHO修改糖尿病标准如下： 空腹血糖(FPG)的分类：60mmolL为正常；6070mmolL为空腹血糖过高(未达糖尿病，简称IFG)；70mmolL为糖尿病(需另一天再次证实)。空腹血糖的定义是至少8小时没有热量的摄入。 可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未到达糖尿病诊断标准者应行此试验。成人采用75g葡萄糖负荷，儿童175g/kg，正常人血糖顶峰出现于服糖后1/21h，峰值不超过8910mmol/L(160180mg/dl)。采用放射免疫法测定的胰岛素包括胰岛素原及与抗体结合的胰岛素。C肽测定不受胰岛素抗体影响，不与胰岛素产生交叉免疫反响，也不

3、受外源性胰岛素干扰。1型糖尿病空腹血浆胰岛素和C肽水平很低，2型糖尿病那么多为正常或增高。本试验的方法与OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，120，180min时采血同时测胰岛素或C肽，以直接了解胰岛细胞的功能状态。正常人血胰岛素和C肽的顶峰与血糖顶峰一致，于服糖后3060分钟胰岛素测值为空腹的510倍，C肽测值为空腹的56倍。1型糖尿病患者糖负荷后无胰岛素和C肽释放反响峰，其释放曲线呈低平状态；2型糖尿病肥胖患者，糖负荷后胰岛素和C肽释放反响峰值正常或增高，但顶峰却在2h后延迟出现；病程已久消瘦2型糖尿病患者胰岛素和C肽的释放反响峰值低于正常。糖基化血红蛋白(GHb)含量与血糖浓度呈

4、正比，可反映23个月前体内血糖的平均水平。糖基化血红蛋白的主要成分为HbAlc，因此常以HbAlc代表GHb。GHb(或HbAlc)的测值因测定方法不同而略有差异，约在36%63%的范围之内。未控制的糖尿病患者GHb可为正常人的2至3倍。自身抗体包括胰岛细胞抗体(ICA)、胰岛素抗体(IAA)及谷氨酸脱羟酶(GAD)抗体测定。1型糖尿病患者血清中该三种抗体可同时存在，亦可仅测到12种。三种抗体中GAD存在的时间较长，于发病10余年后仍可测到该抗体。 三.糖尿病的基因诊断基因突变 分型一、线粒体基因突变二、胰岛素基因突变三、胰岛素受体基因突变四、葡糖糖激酶基因突变五、其他基因突变1、线粒体DNA

5、点突变： 线粒体DNA (m tDNA ) 3243 位点tRNAL eu (UUR)基因A G 突变是DM 的致病基因。2、线粒体DNA缺失突变: 10.4kb缺失(nt4398-14882);7.5kb(nt6080-13800);7.6kb(nt6465-14135)3、线粒体DNA重复突变：Poulton等报道2例，分别为8kbnt6000-15000及8kbnt7000-16000 一、线粒体基因突变二、胰岛素基因突变 应用聚合酶链反响单链构象多态性(PCRSSCP)及等位基因特异性寡核苷酸斑点杂交技术对INS基因进行分析，发现有Arg65His、Arg65leu以及Hisl00As

6、p等点突变。此3种突变均可导致血中胰岛素原不能转换为胰岛素，从而引起高胰岛素原血症。 Moller等对INSR基因的全部外显子筛查后发现，外显子2，3，8，9，13，17中有无义突变，外显子20中存在一个异质性点突变。 (CGGCAG、Argl174Gln) 该突变位于酪氨酸激酶区内，影响受体细胞内亚基的结构，是引起遗传性胰岛素抵抗insulin resistance ，IR的主要原因。三、胰岛素受体基因突变四、葡萄糖激酶基因突变 对GCK的12个外显子作单链构象多态性(SSCP)测序分析进行分子筛查，发现多种GCK突变，到目前为止致NIDDM的GCK突变近30种，以错义突变多见，亦有无义突变

7、、剪接点突变及碱基缺失。五、其他基因突变1己糖激酶(hexokinase，HK2)基因突变2磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突变 3糖原合成酶(glycogen synthetase，GSY)基因突变4载脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受体基因突变糖尿病相关基因诊断技术 等位基因特异性寡核苷酸斑点杂交技术 测序分析进行分子筛查 PCR PCR-SSCP PCR-DGGE 基因芯片 线粒体基因突变糖尿病PCR技术常规方法提取基因组DNA (包括核DNA 和线粒体DNA )。PCR 法扩增含3243 位点的线粒体DNA 片段, 引物R: 52 GTTTTA GGGGCTCTTTGGT 2GAA GA GTT

8、23; 引物F: 52 TTGGA TCA 2 GGACA TCC2CGA TGGTGCA G23。组成PCR 总反响体系50 l, 置热循环仪内, 94变性30 s, 60退火45 s, 72延伸1 m in, 共30 个循环, 最后再72延伸10 m in。用限制性内切酶Apa I 酶切PCR 反响产物。取30 l PCR 反响产物, 再加3. 4 l L 2Buffer 及1 lApa 酶(20 ul) 混匀, 37水浴3 h, 使之充分酶解。酶解产物用溴化乙锭染色, 然后用1. 5% 琼脂糖电泳检测, 最后在紫外灯下观察结果。1 4: 突变; 5、6: 无突变; C: 正常PCR 扩增

9、产物为500 bp。线粒体3243 位点突变者的白细胞中含有野生型和突变型m tDNA , 呈异质性。A G 突变, 形成GGGCCC 序列能被限制性内切酶Apa I 识别。酶切后, 在1. 5% 琼脂糖电泳带上可见500 bp 及重叠在一起的250 bp 2 个片段,无此突变者仅见500 bp 1 个片段。单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)原理：基于序列不同的DNA单链片段，其空间构象亦有所不同，当其在非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其泳的位置亦发 生变化而表现出不同序列单链其电泳迁频率的差异，从而据引判断有无突变存在

10、. 步骤：1、PCR扩增靶DNA。2、PCR产物的快速变性而后快速复性，形成特定空间结构的DNA单链分子。3、非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE。4、PAGE胶的银染。基因芯片gene chip 指通过微阵(Microarray)技术将高密度DNA片段通过高速点样机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如硅片、膜、玻璃片等固相外表，以同位素或荧光标记的DNA待测样品，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。“探针：载玻片或尼龙膜外表的寡核苷酸“样品：标记了荧光或同位素待测靶核酸 DNA、cDNA或RNA近日从武汉大学中南医院了解到, 该院周新教授率领的课题组

11、新近创造的糖尿病基因诊断芯片, 可以通过基因检测在一天之内确诊线粒体型糖尿病。 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激包括不同诱导、不同治疗手段下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能确实立。基因芯片工作流程病例唐同学，男，15岁。三个月前受凉感冒，之后常感觉口渴、总想喝水、感觉没有力气，体重减轻5斤。以为是感冒还没完全好，没有在意，口渴时就喝可乐等甜饮。两天前明显感觉没力气，并出现恶心、呕吐、上腹不适。到医院查空腹血糖22.7mmol/L；尿常规：葡萄糖4+，酮体3+，蛋白-。血常规：WBC13.6*109/L；肝功、肾功、血脂、尿酸、血尿淀粉酶正常；血气分析：PH值 7.05；尿微量白蛋白正常；心电图：窦性心动过速；肝胆脾双肾B超：脂肪肝。体检：血压90/60mmHg，身高169cm，体重48kg，皮肤粘膜较枯燥，双肺呼吸音稍粗，心率110次/分，律齐，心界无扩大，心音正常，各瓣膜听诊区未闻及杂音，双下肢无水肿。诊断：1型糖尿病