乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养

1、乳鼠肾细胞的原代培养、传代培养目的要求一、了解细胞原代培养、传代（继代）培养的基本方法和操作过程。二、初步掌握培养过程中的无菌技术。三、掌握在例置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。用品超净工作台恒温培养箱普通显微镜例置相差显微镜水浴箱、离心机解剖剪、眼科剪镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯培养瓶离心管吸管血球记数板酒精灯单个仪器逐个弹出在屏幕上，小器械逐个弹出在超净台上培养用品RPM11640培养液（含小牛血清及青、链霉素）0.25%胰蛋白霉弹出具体内容试剂库PBS冻存培养液75%酒精RPM11640、0.25%胰蛋白霉、PBS,冻存培养液微热字显示动物细胞及细胞系新生乳鼠（小鼠）中国仓鼠

2、卵巢细胞（CHO）人宫颈癌细胞（HELA）以上三个也为热字显示乳鼠肾细胞原代培养方法1单层细胞培养法所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。步骤培养用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等取材取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠进入盛有75%酒精的烧杯中2-3秒，随即携入超净工作台内。在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置

3、一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污再将肾组织用解剖剪剪成几块再用PBS漂洗，去净血液为止消化将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至0.5mm大小的组织块加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37C水浴中消化20-30分钟，注意应每隔5分钟振摇一次。当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态加入1-2ml培养液终止消化净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入消毒离心管中

4、离心离心及计数离心管平衡后，以800-1000转/分离心8-10分钟，超净工作台内开盖，吸取上清液加入3-5ml培养液，盖盖，注意应有空隙，标明细胞名称，代数，日期。在倒置相差显微镜下观察细胞分散情况后置37C孵箱中培养新生乳鼠（活）*新生乳鼠（死）放在70%酒精烧杯中被平放解剖、组织块在平器中放入PBS清洗组织块入小瓶中被剪刀剪切小瓶放入水浴箱中消化小瓶中液体转移至离心管离心机人面容显微镜（计数33细胞）操作人向培养瓶中放液体培养瓶被放入CO2孵箱。这为一系列照片组成的动画效果显示。原代培养细胞的观察每天要对按种培养的细胞做常规性检查，观察的主要内容是：污染与否细胞生长状态PH（通过培养液颜

5、色变化）如发现培养液变为黄色且又混浊，表明已被污染，这时细胞不易贴壁生长，逐渐死亡。如培养液为桔红色，一般说明细胞生长状态良好在没有发生污染的情况下，一般按规24h,可见到许多细胞贴壁，由圆形悬浮状态的细胞延展成短梭状。培养34天时，细胞生长繁殖，数量增加，可见细胞形成孤立小片（细胞岛）逐渐扩展。细胞透明，颗粒少，界线清楚，状态佳。由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时换液一次。大约710天，原代培养细胞可基本辅满瓶壁，形成致密单层，这时可进行传代培养。方法II组织块培养法组织切成0.51mm的小块后，由于组织块体积很小，再不加任何粘着剂情况下，它们

6、也能直接贴付与瓶壁上，然后细胞从组织块边缘向外长出生长晕，最后连接成片而形成单层细胞。此方法程序简化，是常用的原代细胞培养方法。步骤取材镊同单层细胞培养法洗净的组织块移入消毒平皿中，也可用小瓶代替。用眼科剪反复剪成0.5-1mm小块用吸管滴加几滴培养液，轻轻吹打混匀用吸管分次吸取小碎块悬液，注意吸在吸管前端部，以免吸德过高，组织小块粘附与管壁而丢失将组织碎块在培养瓶低上散开摇匀然后翻转培养瓶，加入2-3ml培养液（15mm2）盖好，标记好，置37C孵箱中培养2-3hr待组织小块略干燥，能牢固贴在瓶壁时，再慢慢翻转培养瓶，使培养液浸泡组织块，净置培养，动作一定要轻，减少振动，否则会使组织块脱落，

7、影响贴壁培养。观察净置培养3天后开始观察，移动培养瓶时要尽量时培养液震荡撞击组织块。注意检查有否污染处，应再显微镜下观察组织小块边缘有否细胞，一般最先出现的时形态不规则的游走细胞，接着是成纤维细胞或上皮细胞当细胞分裂，细胞数量增多时，在组织块周围可见到生长晕随后细胞生长分裂增快，呈放射状向外扩展逐渐连成一片可根据培养液颜色，更换培养液约10-15天后细胞可长成单层，即可传代培养细胞传代（继代）培养当原代培养细胞或已为细胞系细胞，增殖达到一定密度后（一般形成致密单层），则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以适当比率转移到另一个或几3个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是

8、细胞的代数。本实验以Hela细胞为例，显示传代培养过程步骤1倒去细胞培养液（对于小口的培养瓶可采用顷倒方法，对于培养皿，必须用吸管吸出吸取适量的PBS加入培养瓶中，轻轻振荡后弃去重复一次，以清于血清成分，利于胰酶消化加入适量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培养皿可加入1ml,15cm2培养瓶加入5-8滴）转动培养瓶，使其湿润整个细胞房，高温下消化2-3分钟。翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可顷去消化液，如消化程度不够可延长消化时间，或置于37C孵箱中加速胰酶作用如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作加入适量培养液终止消化吸取瓶中

9、培养液反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下轻轻吹打，混匀，成细胞悬液取样计数，调整细胞浓度为5105/ml15cm2培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好，置37C孵箱中培养。手持培养瓶顷倒培养液向培养瓶中加入胰酶（滴加）加入培养液转移到另一培养瓶放入培养箱。为照片显示过程传代培养细胞形态观察细胞传代后，应每日对细胞进行观察，注意是否污染及细胞贴壁和生长情况。在其生长过程中可认为分为5个时期：游离期细胞经消化分散后，由于愿生质收缩及细胞弹性，细胞成圆形，折光性强，呈悬浮状态。吸附期接种24小时后，由于细胞的附壁特性，开始贴壁，圆形细胞变成延展状态。繁殖期细胞快速生长、分裂，形成细胞岛直至细胞单层。维持期细胞形成单层后生长与分裂减缓、折