生物化学与分子生物学：4-蛋白质的生物合成

1、1蛋白质的生物合成第一节 蛋白质生物合成体系第二节 氨基酸的活化第三节 肽链的生物合成过程第四节 蛋白质翻译后修饰和靶向输送第五节 蛋白质生物合成的干扰和抑制2细胞内以mRNA为模板，将mRNA上的4种核苷酸排列顺序转变为蛋白质上20种氨基酸的排列顺序的过程。mRNA是指导翻译的直接模板，蛋白质是基因表达的最终产物。翻译(translation)的概念：3第一节 蛋白质生物合成体系信使RNA（messenger RNA，mRNA) 核蛋白体（ribosomes) 转运RNA（transfer RNA，tRNA) 酶（Enzyme）及多种蛋白因子起始因子(initiation factors,

2、IF)， 真核生物eIF延长因子(elongation factors, EF)释放因子(release factors, RF)氨基酸（amino acids） 能量（ATP and GTP) 4一、mRNA是蛋白质生物合成的直接模板 mRNA是遗传信息的携带者遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子(cistron)。真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子(single cistron) 。原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。原核生物的多顺反子真核生物的单顺反子非编码序列核蛋白体结合位点起始密码

3、子终止密码子编码序列PPP53蛋白质PPPmG -53蛋白质6 mRNA上存在遗传密码mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每相邻3个核苷酸为一组，编码肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码(triplet codon)。起始密码(initiation coden): AUG 终止密码(termination codon): UAA，UAG，UGA 7密码子(codon)： mRNA上每3个相邻核苷酸组成一个三联体(triplet)，编码一种氨基酸，称之为。遗传密码(genetic code): mRNA中蕴藏遗传信息的碱基序列称为，它是密码子的总和。 mRNA上存

4、在遗传密码9很重要的概念！ mRNA上从起始密码子到终止密码子之间的连续编码序列或是DNA上与之对应的序列。一个ORF编码一条完整的多肽链。A reading frame is uninterrupted by translation stop codons.不是任何一段从AUG到终止密码子之间的序列都能称为ORF，通常要求的长度是至少50个密码子。开放阅读框架(open reading frame，ORF)101. 方向性(direction)遗传密码的特点密码子及组成密码子的各碱基在mRNA序列中的阅读方向只能是5到3。 112. 连续性(commaless)编码蛋白质氨基酸序列的各个三联

5、体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。 遗传密码的特点12 基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致移框突变 (frameshift mutation)。 133. 简并性(degeneracy)遗传密码中，除色氨酸和甲硫氨酸仅有一个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。编码同一种氨酸酸的不同密码子第1、2位碱基多相同，前2位碱基决定编码氨基酸的特异性，仅第3位碱基差异。密码的“偏爱性”：同一组密码子的使用频率不同 遗传密码的特点144. 通用性(universal)蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒

6、体、植物细胞的叶绿体。密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。 遗传密码的特点线粒体密码子165. 摆动性(wobble)tRNA上的反密码与密码间不严格遵守常见的碱基配对规律，称为摆动配对。 摆动配对在反密码子的第1位和密码子的第3位间常见。遗传密码的特点摆动配对18密码子、反密码子配对的摆动现象tRNA反密码子第1位碱基IUGACmRNA密码子第3位碱基U, C, AA, GU, CUG19二、核糖体是多肽链合成的装置20原核生物真核生物核蛋白体小亚基大亚基核蛋白体小亚基大亚基S70S30S50S80S40S60SrRNA16S-rRNA5S-rRNA23S-rRNA18S-rRNA

7、28S-rRNA5S-rRNA5.8S-rRNA蛋白质rpS 21种rpL 36种rpS 33种rpL 49种原核、真核生物核蛋白体的组成 原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式A位：氨基酰位(aminoacyl site)P位：肽酰位(peptidyl site)E位：排出位(exit site)22三、 tRNA是氨基酸的运载工具反密码环氨基酸臂T环DH环 23tRNA的三级结构示意图24四、蛋白质生物合成需要的酶类、蛋白质因子等重要的酶： 氨基酰-tRNA合成酶，转肽酶，转位酶蛋白质因子：起始因子(initiation factors, IF)， 真核生物eIF延长因子(elongation

8、 factors, EF)，真核eEF释放因子(release factors, RF) , 真核eRF能源物质及离子： ATP，GTP，Mg2+,K+25氨基酸 + tRNA氨基酰- tRNAATP AMPPPi氨基酰-tRNA合成酶 第二节 氨基酸的活化 氨基酸活化过程，即氨基酸与特异tRNA结合形成氨基酰-tRNA的过程。氨基酸ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi 第一步反应第二步反应28氨基酰-tRNA合成酶氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetase, aaRS)具有绝对专一性，及校正活性(editing activity)。只有20种. 一种tRNA

9、只能结合一种氨基酸，一种氨基酸可结合多种tRNA(称为同功tRNA)。29举例： Ala-tRNAAla Met-tRNAMet真核生物起始者tRNA(initiator-tRNA): tRNAiMet肽链延长中携带Met的tRNA： tRNAeMet原核生物起始者tRNA: tRNAfMetfMet： N-甲酰甲硫氨酸氨基酰-tRNA的表示法30第三节 肽链的生物合成过程是翻译的中心环节，是活化氨基酸在核蛋白体上的缩合过程(核蛋白体循环，ribosomal cycle)核蛋白体循环（广义）：起始、延伸、终止三个阶段从5AUG开始直至终止密码子核蛋白体沿着mRNA从5向3方向移动肽链的合成是从

10、N端到C末端31一、原核生物的肽链合成过程（一） 起始核蛋白体大、小亚基的分离mRNA与30S小亚基的结合fMet-tRNA与mRNA及30S小亚基的结合50S大亚基的结合起始复合物：fMet-tRNAfMet-mRNA-核蛋白体原核、真核生物各种起始因子的生物功能 促进核蛋白体分离成大小亚基eIF-6促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合大亚基eIF-5eIF-4F复合物成分，结合eIF-4E和PABeIF-4GeIF-4F复合物成分，结合mRNA5帽子eIF-4E结合mRNA，促进mRNA扫描定位起始AUGeIF-4BeIF-4F复合物成分，有解螺旋酶活性，促进mRNA结合小亚基IF-4A

11、最先结合小亚基促进大小亚基分离eIF-2B，eIF-3促进起始tRNA与小亚基结合eIF-2真核生物促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA敏感性-3促进起始tRNA与小亚基结合-2占据A位防止结合其他IF-1原核生物生物功能起始因子促进核蛋白体分离成大小亚基eIF-6促进各种起始因子从小亚基解离，进而结合大亚基eIF-5eIF-4F复合物成分，结合eIF-4E和PABeIF-4GeIF-4F复合物成分，结合mRNA5帽子eIF-4E结合mRNA，促进mRNA扫描定位起始AUGeIF-4BeIF-4F复合物成分，有解螺旋酶活性，促进mRNA结合小亚基IF-4A最先结合小亚基促进大小亚基分离

12、eIF-2B，eIF-3促进起始tRNA与小亚基结合eIF-2真核生物促进大小亚基分离，提高P位对结合起始tRNA敏感性IF-3促进起始tRNA与小亚基结合IF-2占据A位防止结合其他tRNAIF-1原核生物1. 核蛋白体大小亚基分离IF-3IF-1AUG53IF-3IF-12. mRNA在30S小亚基定位结合mRNA 起始密码子上游SD序列（核蛋白体结合位点，RBS）-AGGAGG-，使mRNA与小亚基结合。mRNA上SD序列后的核苷酸序列可被核蛋白体小亚基蛋白rps-1结合。SD序列(Shine-Dalgarno sequence )，也叫做核蛋白体结合位点(ribosomal bindi

13、ng site, RBS)2. mRNA在30S小亚基定位结合IF-3IF-1IF-2GTP3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAfmet )的结合AUG534. 核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成IF-3IF-1IF-2GTPGDPPiAUG5338IF-3IF-1AUG53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi39（二） 肽链的延伸又称狭义的核蛋白体循环，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步：进位(entrance)或称注册(registration)成肽(peptide bond formation)转位(translocation) 一、原核生物的肽链合成过程原核延长因子生物

14、功能对应真核延长因子EF-Tu促进氨基酰-tRNA进入A位，结合分解GTPEF-1EF-Ts调节亚基EF-1EF-G有转位酶活性，促进mRNA-肽酰-tRNA由A位前移到P位，促进卸载tRNA释放EF-2延长因子(elongation factor, EF)又称注册 (registration)1. 进位指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。 延长因子EF-T：EF-Tu和EF-Ts亚基的二聚体。 2. 成肽由转肽酶(transpeptidase)催化的肽键形成过程。3. 转位463. 转位延长因子EF-G有转位酶( translocase )活性，可结合并

15、水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动。起始二肽酰-tRNA-mRNA相对位移入核蛋白体P位，而卸载的tRNA移入E位。A位空留并对应下一组三联体密码，准备适当氨基酰-tRNA进位开始下一核蛋白体循环。进位转位成肽fMetAUG53fMetTuGTP肽链的延伸49当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。 （三） 终止一、原核生物的肽链合成过程50一是识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识别UAA、UGA。RF-3 具有GTP酶活性二是诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基

16、转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。 释放因子的功能释放因子 (release factor, RF) 原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：eRF （三） 终止原核肽链合成终止过程 UAG53RFCOO-原核肽链合成终止过程 1氨基酸的活化20种氨基酸20种氨基酰-tRNA合成酶32种（或多于32种）tRNAATP、Mg2+2起始mRNAN-甲酰甲硫氨酰-tRNAfmermRNA上的起始密码子（AUG）30S核糖体亚基50S核糖体亚基起始因子（IF-1, IF-2, IF-3）GTP、Mg2+3延长具有功能的70S核糖体（起始复合物）密码子特异的氨基酰-

17、tRNA延长因子（EF-Tu, EF-Ts, EF-G）GTP、Mg2+4终止与释放mRNA上的终止密码释放因子（RF-1, RF-2, RF-3）5折叠和翻译后的加工特异酶、辅助因子、除去起始残基和信号肽所需的化合物，水解过程，末端残基的修饰，磷酸、甲基、羧基、碳水化合物或辅基结合到蛋白质上。阶段必需化合物1氨基酸的活化20种氨基酸20种氨基酰-tRNA合成酶32种（或多于32种）tRNAATP、Mg2+2起始mRNAN-甲酰甲硫氨酰-tRNAfmermRNA上的起始密码子（AUG）30S核糖体亚基50S核糖体亚基起始因子（IF-1, IF-2, IF-3）GTP、Mg2+3延长具有功能的7

18、0S核糖体（起始复合物）密码子特异的氨基酰-tRNA延长因子（EF-Tu, EF-Ts, EF-G）GTP、Mg2+4终止与释放mRNA上的终止密码释放因子（RF-1, RF-2, RF-3）5折叠和翻译后的加工特异酶、辅助因子、除去起始残基和信号肽所需的化合物，水解过程，末端残基的修饰，磷酸、甲基、羧基、碳水化合物或辅基结合到蛋白质上。阶段必需化合物大肠杆菌蛋白质合成的5个阶段所需化合物54二、真核生物的肽链合成过程（一）起始核糖体大小亚基分离Met-tRNAimet与小亚基结合mRNA在核糖体小亚基上就位核糖体大亚基结合 特点： 40S小亚基先结合Met-tRNAiMet，再结合mRNA5

19、5Kozak规则起始密码子AUG周边碱基组成符合特定规则时翻译的效率更高，称为Kozak规则。若将起始AUG中的碱基分别标为1，2，3位，可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)5端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说，满足前两项即可。 56真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。（二）延长57（三）终止与原

20、核相似，但只一种释放因子，可识别所有终止密码子多聚核蛋白体(polysome)使蛋白质合成高速、高效进行。电镜下的多聚核蛋白体现象翻译一条氨基酸残基数为N的多肽链所需的ATP氨基酸活化： ？肽链合成的起始： ？肽链延长时的进位： ？肽链延长时的转位： ？翻译的终止： ？总共需ATP数：61概念：翻译，密码子，遗传密码，ORF遗传密码的特点：方向性，连续性，简并性，通用性，摆动性核蛋白体的组成原核(70S)：30S + 50S 真核(80S)：40S + 60SP位与A位氨基酸的活化翻译的起始、延伸、终止小 结 62翻译后加工和输送第 四 节Posttranslational Processin

21、g & Protein Transportation63肽链合成后的加工多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰高级结构修饰 64一、多肽链折叠为天然功能构象的蛋白质肽链合成开始, 新生肽链的折叠即开始。一级结构是空间构象的基础。天然蛋白质折叠通常需要其他酶、蛋白辅助。 65促进蛋白折叠功能的大分子1. 分子伴侣 (molecular chaperon) 2. 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI)3. 肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-trans isomerase, PPI)67分子伴侣是一类保守蛋白质，可识

22、别肽链的非天然构象。原核真核均有，类型多种，分多个家族，作用时需ATP供能。不同分子伴侣功能不尽相同：促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠或组装。防止新生多肽链或待组装的蛋白亚基非正常聚集，避免形成无功能的结构（非正确折叠或组装的大分子结构对细胞通常是有害的）帮助修复非正确折叠的蛋白质参与蛋白质跨膜转运辅助蛋白质的降解伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程 69二、一级结构的修饰（一）肽链N端的修饰（二）个别氨基酸的修饰（三）多肽链的水解修饰70（一）肽链N端的修饰大多天然蛋白质不以甲硫氨酸为N端第一位氨基酸脱甲酰基酶或氨基肽酶可以除去N-甲酰基、N端甲硫氨酸或N端附加序列。约50%

23、的真核蛋白质会有N-端氨基酸的乙酰化71（二）个别氨基酸的修饰某些蛋白质肽链中存在共价修饰氨基酸残基糖基化羟基化乙酰化甲基化磷酸化羧基化二硫键生成亲脂性修饰72（三）多肽链的水解修饰某些无活性的蛋白前体可经蛋白酶水解，生成活性的蛋白质、多肽，如胰岛素原酶解成胰岛素。真核细胞某些大分子多肽前体，经水解生成数种小分子活性肽。前胰岛素原加工成为有活性的胰岛素前导序列的切除二硫键的生成C肽的切除鸦片促黑皮质素原(POMC)的水解修饰NC信号肽PMOCKRKR103肽 ( ？)ACTH-LT-MSH-MSHEndophin75三、高级结构的修饰（一）亚基聚合 （二）辅基连接76蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。 四、蛋白质合成后的靶向输送蛋白质的靶向输送(protein targeting)77所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号，主要为N末端特异氨基酸序列，可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位，这一序列称为信号序列 。 信号序列 (signal sequence)78（一）分泌蛋白的靶向输送真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网。 信号肽(signal peptide) ：未成熟蛋白质中可被细胞转运系统识别的特征性氨基酸序列，一般由1040多个氨基酸残基组成。信号肽的一级结构信号肽引