细菌鉴定之生化反应（基础课堂）

1、细菌鉴定之生化反应南医大三附院检验科 江培涛1智囊经验常用试验碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验各种酶类试验抑菌试验2智囊经验一 碳水化合物的代谢试验1 糖（醇、苷）类发酵试验原理：细菌含有发酵糖（醇、苷）的酶分解糖类产酸、产气、或仅产酸 培养基：含有0.5%1%的糖（醇、苷）的液体、半固体、固体、或 微量生化管方法： 纯菌种接种培养基，要求的温度，数小时至两周，微量管注意保持湿润，以免干燥结果：能分解糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应 若能产气时，培养基可出现开裂气泡等现象意义：肠杆菌科尤为重要3智囊经验2 氧化-发酵试验（O/F）原理：细菌分解葡萄

2、糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；可以进行无氧降解的，称为发酵型；不分解葡萄糖的称为产碱型培养基：HL二氏培养基方法；待测菌同时接种两只HL培养基，其中一只滴加无菌的液体石蜡，高度不少于1cm，35培养48h或更长结果：两只均无变化为产碱型；两只均产酸为发酵型；仅不加石蜡的产酸为氧化型意义：肠杆菌科与非发酵菌的鉴别；葡萄球菌与微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型4智囊经验3 ONPG（半乳糖苷酶试验）原理：有的细菌可以产生半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚- 半乳糖苷生成黄色的邻-硝基酚方法：从KIA上取菌，于0.25ML无菌生理盐水中制菌悬液，加甲苯一滴，使酶释放。37 水浴5min,

3、加0.25mlONPG试剂，水浴20min-3h观察结果结果：呈现黄色为阳性，一般20-30min内显色意义：迅速及迟缓发酵乳糖的细菌为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定注意：该试验不一定与分解乳糖相一致，决定于细菌产生的酶及其活性5智囊经验七叶苷水解试验原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物，使培养基呈黑色方法：将待测菌接种于七叶苷培养基，培养后观察结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：D群链球菌与其他链球菌的区别，前者为阳性；肺炎克雷伯、阴沟肠杆菌多阳性6智囊经验V-P试验原理：细菌分

4、解葡萄糖产生丙酮酸，后者脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为V-P试验阳性。奈酚可加速此反应培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基，35 48h，加入甲液（6%奈酚酒精溶液）和乙液（40 %KOH溶液）结果：20min内出现红色为阳性，如无红色，且于35 4h 后仍如故即为阴性意义：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后者多阴性7智囊经验甲基红试验原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的PH降至4.5以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少，或进一步转化为其

5、他物质，则培养基的PH仍在6.2以上，加入甲基红试剂后显黄色，为阴性培养基：葡萄糖蛋白胨水方法：待测菌接种于培养基，2-4天后，加入甲基红试剂，观察结果结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性意义：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸杆菌、等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性8智囊经验7 葡萄糖酸盐试验原理：某些细菌能氧化葡萄糖酸盐作为唯一碳源，生成2-酮基葡萄糖酸盐。加入班氏试剂，于沸水煮沸10分钟，出现砖红色沉淀，表明有葡萄糖酸盐的存在培养基：2-酮基葡萄糖酸盐肉汤方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24h，于其中加入0.3ml浓缩班氏试剂，然后沸水中煮沸10分钟，出现砖红色沉淀

6、表明有葡萄糖酸盐的存在意义：用于肠杆菌科分类9智囊经验二 蛋白质和氨基酸的代谢试验1 明胶液化试验原理：细菌产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体变为液体方法：待测菌接种于明胶培养基，22 培养7天。若用35 孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察前先置4 冰箱30min再观察结果：培养基呈液化状态为阳性意义：多数假单胞菌能液化明胶，肠杆菌科细菌如：沙雷菌、变形杆菌、 阴沟杆菌等可液化明胶10智囊经验2 吲哚（叮基质）试验 原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚培养基：蛋白胨水方法：待测

7、菌接种于培养基，35 培养24-48小时，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂结果：于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性意义：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性试剂：柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）与欧氏试剂的区别：前者含戊醇，后者含酒精，都含浓盐酸，前者主要成分为后者10倍，后者灵敏度更高11智囊经验硫化氢试验原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。培养基：醋酸铅培养基方法：待测菌接种于醋酸铅培养基，35 培养24-48小时观察结果结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性意义：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌

8、为阳性12智囊经验4 尿素分解试验原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性培养基：尿素培养基方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时观察结果结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性意义：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷伯氏为阳性13智囊经验5 苯丙氨酸脱氨酶（TDA）试验原理：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应培养基：苯丙氨酸琼脂培养基方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时，加10%三氯化铁试剂3-4滴，观察结果结果：肠杆菌科变形杆菌、普罗维登氏菌、摩根氏菌阳性14智

9、囊经验6 氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显色培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基方法：待测菌接种于培养基，并加入无菌液体石蜡，35 培养18-24小时观察结果结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色，（指示剂为溴甲酚紫）测定管呈黄色为阴性；若对照管呈紫色则试验无意义意义：肠杆菌科细菌的鉴定15智囊经验三 碳源和氮源利用试验枸橼酸盐利用试验原理：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱培养基：枸橼酸盐培养基方法：待测菌接种于培养基35 培养18-24小时，观察结果结果：培养基

10、中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，不变色为阴性意义：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性16智囊经验丙二酸盐利用试验原理：有的细菌可利用丙二酸盐为唯一碳源，将其分解生成碳酸钠，使培养基变碱培养基：丙二酸盐培养基方法：待测菌接种于培养基35 培养18-24小时，观察结果结果：培养基由淡绿变为深蓝为阳性，无变化则为阴性意义：肠杆菌科属间鉴别17智囊经验四 各种酶类试验1 氧化酶试验原理：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶，。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺方法：菌落

11、法、滤纸法、试剂纸片法。前二者浪费试剂，后者节省结果：10秒内呈深紫红色为阳性应用：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别，前者阴性，后者多阳性奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性18智囊经验2 触酶试验原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡试剂：3%过氧化氢溶液方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3%过氧化氢数滴，观察结果结果：出现大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性意义：用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄球菌和微球菌为阳性，链球菌和肠球菌为阴性，肠球菌多假阳性19智囊经验硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，氨再转化为氨基酸和其他含氮化合物；硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸系统

12、中的终末受氢体。有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐，有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵，有的能使其还原为氮培养基：硝酸盐培养基试剂：甲（对氨基苯磺酸），乙（奈胺）方法：待测菌接种于培养基，35 培养18-24小时，将甲乙液分别加入培养基，立即观察结果结果：出现红色为阳性注意：若加入试剂后无反应，可能是硝酸盐没有被还原，试验阴性硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性意义：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气；链球菌肠球菌阴性，葡萄球菌阳性20智囊经验4 DNA酶试验原理：某些细菌产生DNA酶，可使长链DNA水解，后者可被酸

13、沉淀，长链DNA水解后形成的寡核苷酸链则溶于酸，所以在平板上加入酸后会在菌落周围形成透明环培养基：0.2%DNA琼脂平板方法：点种被测菌于上述平板， 35 培养18-24小时；用1mol/L盐酸覆盖平板，观察结果结果：菌落周围出现透明环为阳性意义：金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、变形杆菌阳性21智囊经验凝固酶试验原理：致病性葡萄球菌；结合凝固酶、游离凝固酶；纤维蛋白原变为纤维蛋白使血浆凝固方法：1 玻片法检测结合凝固酶 兔血浆 2试管法检测游离凝固酶 0.5ml兔血浆37 水浴3-4结果：玻片法中有明显颗粒样凝集而盐水对照无凝集为阳性 试管法以血浆凝固为阳性意义：致病性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌多阳性

14、22智囊经验6 CAMP试验原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的溶血毒素的活性，在两菌的交界处溶血力加强，出现矢形溶血区培养基；BAP方法：先以产溶血毒素的金葡菌划一横线接种于BAP，再将被测菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，0.5-1cm，37 培养18-24小时观察结果，设阴阳性对照结果：在两划线交界处出现箭头样溶血区为阳性意义：B群链球菌阳性，马红球菌出现反CAMP现象23智囊经验胆汁溶菌酶试验原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，使细菌发生自溶试剂：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁方法： 平板法：滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35 30min观察结果 试管法：0.9

15、ml被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1ml后置35 水浴10-30min观察结果结果：菌落消失，或培养物变透明为阳性意义：肺炎链球菌阳性24智囊经验8 脂酶、卵磷脂酶、硷性磷酸酶主要用于厌氧菌的鉴定产气夹膜梭菌卵磷脂酶阳性中间类杆菌脂酶阳性致病性葡萄球菌硷性磷酸酶阳性，如金葡等25智囊经验26智囊经验五 抑菌试验1 O/129试验原理： O/129（二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用培养基；碱性琼脂培养基方法：纸片法药敏 40ug/片结果：有抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药意义：弧菌、邻单胞菌敏感；气单胞菌属耐药27智囊经验杆菌肽试验原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而

16、其他链球菌则耐药培养基：BAP方法：同纸片法药敏0.04U/片结果：10mm敏感；10mm耐药意义：A群链球菌敏感28智囊经验3 奥普托欣Optochin试验原理：肺炎链球菌对Optochin敏感，其他链球菌无抑制作用培养基：BAP方法：同纸片法药敏 5ug/片结果：抑菌环直径14mm敏感；14mm耐药此时加做胆汁溶菌试验证实意义：肺炎链球菌对Optochin敏感29智囊经验4 新生霉素敏感试验原理：表皮葡萄球菌对新生霉素敏感；腐生葡萄球菌对新生霉素耐药培养基：MH琼脂方法：同纸片法药敏 5ug/片结果：抑菌环直径16mm敏感；16mm耐药意义：区别表皮葡萄球菌与腐生葡萄球菌30智囊经验氢氧化钾拉丝试验 (1)原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。(2)方法：取1滴40g/L氢氧化钾水