2第十三章 酶类药物

1、第十三章 酶类药物1第一节 药用酶概述大多数酶制剂为口服剂型，现能由于注射的酶制剂只有细胞色素C、纤溶酶等少数几种。目前对药用酶的研究热点是，在维持活性状态下的酶蛋白能否被吸收，如何将少药用酶的抗原性问题及新型药用酶的研究等。一、药用酶的分类及应用（一）促进消化酶类（二）消炎酶类（三）与治疗心脑血管疾病有关的酶类（四）抗肿瘤的酶类（五）与生物氧化复原电子传递有关的酶（六）其他药用酶2二、药用酶的来源和生产（一）药用酶的来源酶作为生物催化剂普遍存在于动植物和微生物中，可直接从生物体中别离获得。酶可以通过化学合成法合成，但由于各种因素的限制，目前药用酶的生产主要是直接从动植物种提取、纯化和利用微生

2、物发酵生产。近10多年来，动植物细胞培养技术取得了很大的进步，但因为周期长，本钱高等问题，实际应用还有一定困难。目前工业大规模生产一般都是以微生物为主要来源。（二）生化制备法生化制备法的主要生产过程为：31、原料选择应注意的问题（1）了解目的酶在生物材料中的分布特点，选择适宜的生物材料。（2）考虑生物在不同发育阶段及营养状况时，酶含量的差异及杂质干扰的情况。（3）用动植物组织作原料，应在动物组织宰杀后立即取材。（4）考虑生化制备的综合本钱。2、生物材料的预处理（1）机械处理（2）反复冻融处理（3）制备丙酮粉（4）微生物细胞的预处理43、酶的提取（1）水溶液法 常用稀盐溶液或缓冲液提取，经过预处

3、理的原料，包括组织糜，匀浆，细胞颗粒，丙酮粉都可用水溶液抽提。 水溶液的pH选择对抽提具有影响，应考虑的因素有：酶的稳定性酶的溶解性酶与其他物质结合的性质选择pH的总原则是，在酶稳定的pH范围内，选择偏离等电点的适当的pH。（2）有机溶剂法 某些结合酶，由于和脂质结合牢固，需用有机溶剂除去脂质，且不能使酶变性。常用有机溶剂是丁醇。丁醇性质：亲脂性强、兼具亲水性、在脂与水分子间能起外表活性剂的桥梁作用。丁醇提取方法：均相法和两相法（3）外表活性剂法54、酶的纯化不同的酶，因性质不同，其纯化工艺可能有很大不同。评价一个纯化工艺好坏，主要看两个指标：酶比活和总活力回收率。纯化过程中的技术难点：（1）

4、杂质的除去调pH和加热沉淀法蛋白质外表变性法选择性变性法降解或沉淀核苷酸法利用结合底物保护法除去杂蛋白（2）脱盐透析凝胶过滤6（3）浓缩冷冻枯燥法离子交换法超滤法凝胶吸水法（4）酶的结晶酶的结晶方法 盐析法、有机溶剂法、复合结晶法、透析平衡法、等电点法结晶条件的选择酶液的纯度酶的浓度温度、时间、pH、晶种、结晶器皿处理7（5）酶别离和纯化中应注意的问题防止酶蛋白变性防止辅助因子流失防止酶被蛋白水解酶降解（三）微生物发酵法1、高产菌株的选育 获取优良菌株有三种途径：从自然界别离筛选用物理或化学方法处理、诱变用基因重组与细胞融合技术，构建性能优良的工程菌。2、发酵工艺的优化3、培养方法（1）固体培

5、养法（2）液体培养法84、影响酶产量的因素（1）温度：一般发酵温度比种子培养时略高，对产酶有利。（2）发酵的pH：可通过培养基原始pH或添加缓冲剂或通过调节通气量等方法实现。（3）通气和搅拌 用于酶生产的微生物，根本都是好氧菌；不同菌种在培养时，对通气量的要求也不同。搅拌能使气泡打碎，增加气液体接触面积，加快氧的溶解速度；搅拌使液体形成湍流，延长气泡在培养液中的停留时间，提高空气的利用率；搅拌可增加液体的湍流作用，有利于热交换和营养物质与菌体细胞的均匀接触，同事稀释细胞周围代谢产物，有利于促进细胞的新陈代谢。9（4）泡沫和消泡剂气泡对发酵过程的影响发酵过程中，泡沫的存在会阻碍二氧化碳排除，影响

6、微生物生长和产物的形成；泡沫层过高，往往造成发酵液随泡沫溢出罐外，浪费原料，还容易染菌；泡沫层过高还会降低发酵罐的利用率。常用消泡剂：天然油类，醇类，脂肪酸，胺类，酰胺类，磷酸酯类，聚硅氧烷等。其中以聚二甲基硅氧烷为最理想的消泡剂。（5）添加诱导剂和抑制剂10第二节 重要酶类药物的性质及生产方法一、胃蛋白酶（一）组成与性质淡黄色粉末，具有肉类特殊的气味及微酸味；吸湿性强、易溶于水，水溶液呈酸性。可溶于70%乙醇和pH=4的20%乙醇中。难溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。枯燥的胃蛋白酶较稳定100度加热10 min不会被破坏；在水中，70度以上或pH=6.2以上开始失活，pH=8以上呈不可逆失活；酸性

7、溶液中较稳定，但在2 mol/L盐酸中会慢慢失活。最适pH=1.5-2.0。结晶胃蛋白酶呈针状或板状，电泳可分出4个组分，其组成元素有N、C、H、O、S、P、Cl。胃蛋白酶能水解大多数天然蛋白质底物，尤其对两个相邻芳香族氨基酸构成的肽键最为敏感。它对蛋白质水解不彻底，产物为胨、肽和氨基酸的混合物。11（二）生产工艺1、工艺流程2、工艺过程及控制要点酸解，过滤脱脂，去杂质浓缩，枯燥3、胃膜素和胃蛋白酶联产工艺胃膜素也是从猪胃粘膜中提取的一种黏蛋白。胃膜素水溶液能被60%以上的乙醇或丙酮沉淀，所以可利用提取胃膜素的母液制备胃蛋白酶。联产工艺：向别离胃膜素的母液中，边搅拌边加冷丙酮，至相对密度0.9

8、1，既有淡黄色胃蛋白酶沉出，静置过夜，去上清液，沉淀真空枯燥，即得胃蛋白酶。4、结晶胃蛋白酶的制备12（三）质量控制1、质量标准2、活力测定13二、尿激酶 是一种碱性蛋白，由肾脏产生，主要存在于人及哺乳动物的尿中。人尿中平均含量5-6IU/mL。临床上尿激酶已经广泛用于治疗各种新血栓形成或血栓堵塞疾病。（一）结构与性质存在多种相对分子质量形式，主要的有31300、54700两种。尿中存在尿胃蛋白酶原，酸性条件下可以激活生成尿胃蛋白酶，可以把分子量54700的天然尿激酶降解成分子量31300的尿激酶。尿激酶是丝氨酸蛋白酶，丝氨酸和组氨酸是其活性中心的必须氨基酸。尿激酶是专一性很强的蛋白水解酶，尿

9、激酶也有酯酶活力。尿激酶PI为8-9，溶液中不稳定，冻干可稳定数年。14（二）生产工艺1、工艺流程1516（三）质量控制成品为白色或米色澄清溶液或白色冻干粉。每毫克蛋白的酶活力不得低于120000 IU。尿激酶活力测定方法：（1）气泡上升法试剂：血纤维蛋白原溶液、牛凝血酶溶液、血纤维溶酶原溶液、尿激酶标准品溶液。反应体系：四种溶液的混合体系。操作：12 mm*75 mm小试管，置于冰水浴中，依次参加上述溶液，迅速搅拌，立即置于37度水浴保温。反应体系应在30-45s凝结，凝块内有小气泡生成。当凝块溶解时，气泡逐渐上升，在气泡上升到反应体系体积一半时作为反应终点。标准取消：以酶浓度为纵坐标，凝块

10、溶解时间为横坐标，绘制标准曲线。样品测定：被测样品稀释成10-20IU/ML，同以上操作，根据凝块溶解时间，从标准曲线查得样品的活力单位。 17（2）平板法18三、门冬酰胺酶（一）结构与性质门冬酰胺酶是酰胺基水解酶，是从大肠杆菌菌体中提取别离的酶类药物，可用于治疗白血病。呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚及甲醇。20%水溶液，室温储存7天，5度储存14天均不减少酶的活力。干品50度，15min酶活力降低30%，60度1h内失活，最适pH=8.5，最适作用温度37度。（二）生产工艺1、工艺流程192、工艺过程及控制要点20（三）活性测定方法测定原理：门冬氨酸酶催化天冬酰胺水解

11、，释放游离氨。奈斯勒试剂与氨反应后形成红色配合物，可借比色法进行定量测定。实验过程：取0.04mol/L的L-天冬酰胺1 ml，0.5mol/L pH=8.4的硼酸缓冲液、0.5 ml细胞悬浮液或酶液，于37度水溶液中保温15 min，加15%三氯醋酸0.5 mL，以终止反应。沉淀细胞或酶蛋白，离心，取上清液1 mL。加2 mL奈斯勒试剂和7 mL蒸馏水15 min后，于500 nm波长下比色测定产生的氨。活力单位定义：每分钟催化天冬酰胺水解1 umol氨的酶量定为一个活力单位。21四、超氧化物歧化酶（SOD）SOD是一种重要的氧自由基去除剂，能专一清楚超氧阴离子自由基。目前SOD临床应用集中

12、在自身免疫性疾病上，也可用于抗辐射，抗肿瘤，治疗氧中毒，心肌缺氧与缺血再灌注综合症一级某些心血管疾病。SOD属于重金属酶，广泛存在于动植物、微生物细胞中。（一）结构和性质 SOD的性质不仅取决于蛋白质局部，还取决于活性中心金属离子的存在，金属离子种类不同，SOD的性质有所不同，其中Cu，Zn-SOD与其他两种SOD差异较大，而Mn-SOD与Fe-SOD之间差异较小。221、SOD活性中心和构象232、SOD的理化性质 SOD是一种金属蛋白，因此它对热、pH及其在某些性质上表现出异常的稳定性。（1）热稳定性 （2）pH对SOD的影响在pH=5.3-10.5范围内对SOD活性不受影响。pH=3.6

13、时SOD中Zn要脱落95%。pH=12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变，从而导致酶活性丧失。（3）吸收光谱 取决于酶蛋白和金属辅基。紫外光谱区：250 nm-270 nm可见光区：680 nm244、金属辅基与酶活性 Cu与Zn的作用是不同的Zn仅与酶分子结构有关，而与催化活性无关。Cu与催化活性有关，透析除去Cu则酶活性全部丧失，一旦重新参加Cu，酶活性又可以恢复。25（二）生产工艺1、收集红细胞2、溶血、去血红蛋白3、沉淀、热变性4、柱层析5、冷冻枯燥26（三）检测方法1、SOD的纯度鉴定（1）均一性（2）酶比活（3）理化性质2、SOD活性测定2728五、组织纤溶酶原激活剂（t-PA）一类存在于人体组织中的组织激活剂。主要由血管内皮细胞和组织细胞合成，存在于哺乳动物血浆中。主要作用：作用于纤维蛋白溶酶原，特异性裂解溶酶原中的精氨酸-缬氨酸键。t-PA与纤维蛋白结合产生的t-PA-纤维蛋白复合物，能高效、特异地激活血凝块中的纤溶酶原，因此是一种高效特异性血栓溶解药物。t-PA释放减少见于高脂血症病人，尤其是高三酰甘油血症、肥胖症、口服避孕药等的病人。t-PA的活性在夜间及清晨最低，白天可增高达3倍，说明内皮细胞合成与分泌t-PA还与时间有关。（一）氨基酸特征2930（二）理化性质及生物学活性 t-PA