《 胚胎工程第二节 胚胎工程课件》高中生物浙科版选修3 现代生物科技专题1146

1、胚胎工程的主要技术与应用胚胎工程胚胎工程指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术。研究对象：主要限定于高等脊椎动物，特别是哺乳动物。研究内容：体外受精、胚胎体外培养、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞等。理论基础：哺乳动物的受精卵和早期胚胎的发育规律一、体外受精技术超数排卵超数排卵：得到较正常情况下更多的成熟的卵母细胞活体取卵：一般要经过体外成熟培养才能受精屠宰后母畜卵巢上取卵：需经成熟培养（二）胚胎移植技术1.概念:将发育的早期胚胎分别移植到同期发情的代孕母的子宫内，通过代孕母妊娠产仔的技术。供体：提供胚胎的个体。受体(代孕母）：接受胚胎的个体。由于无法进行全体外胚胎培养，目前，胚胎

2、移植成为胚胎工程中获得后代的唯一方法。选择供体母牛受体母牛同期发情处理超数排卵供体公牛配种冲卵质量检查、培养胚胎移植妊娠检查分娩（胚胎移植的犊牛）2.胚胎移植的基本程序3.胚胎移植成功与否要有两个条件（1）胚胎移植一般在同种的供体和受体之间进行。（2）进行胚胎移植的供体和受体的生理状态要相同。4.胚胎移植的生理学基础1)供体和受体相同的生理环境2)早期胚胎处于游离状态,为胚胎的收集提供了可能3)受体对移入子宫的胚胎基本上不发生免疫排斥4)胚胎与受体建立正常的联系,但遗传物质没有改变.（三）胚胎分割技术（Embryo bisection）1.概念:借助显微操作技术或徒手操作方法切割早期胚胎成二、

3、四等多等份再移植给受体母畜，从而获得同卵双胎或多胎的生物学新技术。来自同一胚胎的后代有相同的遗传物质，因此 胚胎分割可看成动物无性繁殖或克隆的方法之一。2.特点:后代具有相同的遗传物质，胚胎克隆.3.选择的胚胎:发育良好的,形态正常的卵裂球、桑椹胚或囊胚。4.使用的主要仪器：实体显微镜和显微操作仪注意：对囊胚阶段的胚胎进行分割时，要将内细胞团均等分割。原因：内细胞团一般到囊胚阶段才出现，它是发育为胚胎本身的基础细胞，其他细胞为滋养细胞，只为胚胎和胎儿发育提供营养。若分割时不能将内细胞团均等分割，会出现含内细胞团多的部分正常发育的能力强，少的部分发育受阻或发育不良，甚至不能发育等问题。胚胎分割技

4、术也是动物克隆的方法之一 。胚胎分割的份数越多，操作的难度会越大，移植的成功率也越低。原因：早期胚胎的体积很小，只有在显微镜下才能看到；再者，细胞数目是有限的。分割的份数越多，不但难以做到均等分割，每一份的细胞数会越少，而且作为囊胚期的胚胎内细胞团细胞所受的影响会更大。因此，分割的份数越多，技术的难度会越大，移植后的恢复和发育的难度会越大，移植成功率自然会降低。 胚胎分割移植的显微操作（四）胚胎干细胞核移植技术核供体：干细胞核 胚胎细胞核 体细胞核核受体：去核的卵母细胞 受精卵 2-细胞胚胎胚胎干细胞核移植胚胎分割胚胎体外培养胚胎移植体外受精基因敲除（gene knock out）基因敲除是指

5、对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。 嵌合体具有来自两个或多个合子体细胞的个体将ES细胞通过显微操作注射到囊胚期胚胎的囊胚腔内，形成嵌合体。囊胚及原肠胚在结构上的主要区别？用来进行体外受精的精子和卵细胞必须满足什么条件？体内正常受精时，精子有获能现象吗？要获得更多的卵细胞，一般采用什么方法？受精卵能直接进行胚胎移植吗？试管动物是在试管里培育成功的吗？试管动物是有性生殖还是无性生殖的产物？超数排卵用什么激素？同期发情用什么激

6、素？什么时期的胚胎可进行胚胎移植？移植到代孕母的什么部位？代孕母接受胚胎前要进行什么处理？什么时期的胚胎可用于胚胎分割？通过胚胎分割培育后代属于有性繁殖还是无性繁殖？对囊胚期胚胎进行分割时要注意什么问题？如果用酶处理法分割胚胎，一般用什么酶？内细胞团的细胞是胚胎干细胞，对吗？只有内细胞团的细胞是胚胎干细胞，对吗？胚胎干细胞具有什么特点？为什么在进行胚胎干细胞培养时要用到胚胎成纤维细胞？胚胎干细胞核移植技术的操作流程？胚胎干细胞核移植过程中哪些阶段体现细胞生长（分裂）、哪些阶段体现细胞的分化？教材上在讲体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞核移植时都提到了什么技术？1.体外受精后形成的受精卵不需经早期发

7、育培养，可直接完成植入或着床（）2.试管动物与胚胎移植的最主要不同是：试管动物从供体获得精子和卵细胞经过成熟培养，在体外人工条件下受精，并经过一段早期发育，再将胚胎移植到受体子宫内。（）3.胚胎分割是指借助显微操作技术将早期胚胎切割成二等份，再移植到代孕母子宫中发育，产生同卵双生后代的技术。（） 4下列关于胚胎工程的叙述，正确的是 A卵裂球中的细胞能直接用于胚胎移植 B精子在体外获能与否主要取决于培养时 间的长短 C分割后的胚胎不能在体外培养而应立即 进行移植 D供体中取出的早期胚胎可直接移植到不 同期发情的受体中1.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是（ ）A.受孕母畜体内的受精卵或胚胎均

8、能移植B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态C.超数排卵技术要使用一定的激素D.试管婴儿只是受精及早期胚胎发育过程在试管中进行2.下列对于优良种畜的胚胎移植的说法不正确的是 （ ）A.供体母牛必须是同一物种的良种B.受体母牛必须是同一物种的良种C.供体公牛必须是同一物种的良种D.受体母牛可以是同一物种的一般健康牛4.利用胚胎干细胞治疗肝衰竭，实现此过程的重要原因是（ ）A.细胞分裂B.细胞特化C.细胞分化D.细胞增殖C三.胚胎干细胞1.概念:简称ES或EK细胞,是由早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞.2.特点:1)形态:体积小.细胞核大,核仁明显.2)功能:具有发育的全能性.可分化为

9、成年动物体内任何一种组织细胞.体外培养可增殖不分化.3）在体外培养的条件下，ES细胞可以增殖而不发生分化。对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。3.主要用途(1)治疗人类的某些顽症(2)培育出人造组织器官，用于器官移植(3)是研究体外细胞分化的理想材料观点理由1.不符合伦理道德(1)把试管婴儿当作人体零配件工厂,是对生命的不尊敬;(2)早期的生命也有活下去的权利,抛弃或杀死多余的胚胎,无异于”谋杀”;(3)有人会滥用设计试管婴儿技术,而设计婴儿性别;2.符合伦理道德(1)设计试管婴儿是为了救人,是救治患者的最好,最快捷的办法之一;(2)提供骨髓中造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤;(3)脐

10、带血乃试管婴儿的”身外之物”.3.中国政府的观点中国卫生部在体外受精-胚胎移植及其衍生技术规范中规定,”实施体外受精-胚胎移植及其衍生技术必须获得卫生部批准证书”.7.2配子操作7.21精子 7.22卵母细胞 7.23体外受精精子的获得精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。 对于个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。人工阴道法人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间充以温水（3840），后端有精液收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。在公猪可以用猪用假阴道收集精液或用手

11、握法采精，但仍需要台畜，使其爬上以便进行操作。 另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的时间，即可射精而得到精液。精液的保存精液的保存可以分为常温（1525）、低温（05）和超低温冷冻（79-196）三种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。 三种保存方法常温保存主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。 低温保存主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。 如果应用超低温可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。 对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。人为使得精子

12、获能可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。 另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能卵母细胞人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性腺激素或黄体激素释放激素（LHRH），对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵，排卵数目不变。 以小鼠为例，通常可用35IU PMSG或23IU hCG或100g FSH 或100gLH或0.020.05g LHRH皮下或腹腔内注射，1214小时可以有70100正常排卵。超数排卵如果一次要

13、获得多个卵，可以利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation） 如在小鼠期涂片相时注射510IU PMSG，4850小时后，再于皮下或腹腔注射510 IU hCG，这种方法可以获得超数排卵。 人的人工采卵和超数排卵，要在月经期59天，每天给予100150mg 克罗米酚，11天或12天用B型超声检测卵巢表面的卵泡直径达到20mm时，再给予40009000 IU hCG，3240小时后取卵。采卵输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大不，用磨尖的钟表镊

14、子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。 对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。采卵3. 对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 4. 对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯

15、套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。卵母细胞一般检测得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查核和胞质发育的状况，如核的形态、位置和所处的时期。 排出的卵母细胞，有多层卵丘细胞包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。 多数实验动物的卵母细胞胞质呈透明状，但由于胞质中富含大量脂滴和空泡，所以在镜下呈暗色。 各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为优秀、普通、不良和异常卵。 进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有34层卵丘细胞，卵母细胞胞质无斑块者为佳。镜检卵母细胞如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林

16、石蜡（1：1）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到4滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。 如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。7.23体外受精体外受精（in vitro fertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。 主要包括：成熟或未成熟的卵母细胞获得、体外培养系统的建立、处理附睾内和射出精子、使精卵结合受精、受精卵的体内或体外培养（in vitro culture，IVC）、移植妊娠和产仔 由于体

17、外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为“试管动物”或“试管婴儿”。历史1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。 1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。过程获得获能的精子和成熟的卵母细胞后，应在塑料平皿底部，用已经处理获能的精子浮游液5l精子浮游液，注入小滴中，将成熟培养后的卵母细胞，或自体内手术冲出的卵母细胞，以BO液冲洗，用微吸管吸10个卵母细胞与少量BO液注入精子浮游液小滴

18、中。在CO2培养箱中培养7小时后再经微量吸管自小滴中用BO液多次冲洗以洗去多余的精子。然后移入发育培养液（TCM19910FCS）继续培养。显微操作协助受精在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡作用。 1976年，Uehara和Yanagimachi将仓鼠或人的精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注射、透明带钻孔和透明带部分切口等几种。卵母细胞质内注射卵母细胞质内注射，是将整个精

19、子或精子头部直接注射到卵母细胞质内。要求注射针的尖端必须锋利，注射吸管内径通常为510m，并尽量避免液体进入卵胞质。此方法可以使任何类型的精子如精子头形不正常、死精子或严重缺陷的精子等，可省去获能和顶体反应。 还可以将1个或多个精子注入透明带下，可以一步直接将精子注射到卵周隙，也可以先将透明带钻孔或部分切口后，再进行精子注射。使用的精子应该是获能和发生顶体反应的。当然，当注射多个精子时可能发生多精受精现象。其它一些方法如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后将吸满酸性台氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流

20、。当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗涤后，再用适当密度的精子进行受精。 先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了超过30的妊娠或出生率，而且并没有增加孤雌活化率和多精受精率。 另外，可以用微细玻璃针或金属微刀片，在透明带上切开或挑开或撕开一个口，再经适当浓度精子受精。试管婴儿的诞生按常规获取精液，经离心洗涤孵育使精子获能，应用PVP液限制精子活动。 人的卵母细胞经正常和超排取得，经Ham F10或T6培养68小时，用透明质酸酶除去卵丘细胞。 注射吸管外径为2.5m，固定吸管外径1520m，内径

21、为4.5m。在显微操作仪下，用注射吸管自尾部将精子吸入16个。用固定吸管吸住卵，使极体在液滴“12”点钟或“6”点钟的位置。注射吸管自“3”点钟位置刺入卵胞质内注入一或多个精子，其后轻微撤出注射吸管，将卵母细胞由固定吸管释放下去。 注射完后，经过培养卵裂后，即可以移植。 一般只要卵子正常，精子的核正常而外形异常的都可以通过体外受精诞生试管婴儿。体外受精的意义可以用来研究受精机理， 治疗人类男性和动物的生殖不育， 可以利用体外受精卵的发育状况或染色体核型检测用来检测形态不正常精子其染色体是否正常， 可以产生大量的转基因动物， 还可以简化烦杂的冻精技术，或许只保存核物质，就可以达到受精的目的，这对

22、保护珍贵的动物资源，将起到重要的作用。 总之，体外受精技术已经广泛应用于发育生物学、医学、畜产学、实验动物学等各个领域。7.3胚胎操作7.31胚胎培养 7.32胚胎移植 7.33胚胎保存 7.34胚胎分割 7.35胚胎嵌合胚胎收集胚胎培养之前，先从动物子宫内将胚胎收集 不同的动物其收集方法是不一样的。 以小鼠为例，一般用颈部脱臼法杀死小鼠，开腹取出子宫和输卵管并将其各部分离，分别放于37生理盐水或M2BSA中，在实体显微镜下，用尖钟表镊子撕开输卵管，可以见到受精卵或卵裂胚胎，亦可以冲洗法将胚胎冲到平皿中。如冲洗囊胚，可用注射器针头自子宫角的输卵管端插入，推入0.20.5ml M2BSA液，将胚

23、胎冲到平皿中。 对于像牛等大型动物而言，如果要取受精卵或早期卵裂胚，应用手术方法冲洗输卵管或将牛杀死取出输卵管冲洗之。但6天后的胚胎，已经移行到子宫角前部，可以用非手术的方法取之。7.31胚胎培养培养开始之前，对实验室和所用的培养器具进行彻底清洗、灭菌、清除可能的残存的细胞毒性物质。 培养液的组成，包括水、无机离子、有机成分、能源物质、pH值、渗透压等对胚胎发育均有很大影响。 现代培养液分为如Whitten氏液、Brinster液、BMOC3和CZB液等简单培养液和TCM199、CMRL 1066、Ham氏液和DMEM液等复杂培养液两类。培养方法即微滴培养法、输卵管培养法和中间受体培养法。 微

24、滴培养法是利用塑料平皿制成50l培养液小滴数个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后将培养皿放到5CO2、95空气饱和湿度的37.5CO2培养箱中培养所需要的时间。如果更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。 输卵管培养法取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。 中间受体培养法是指，操作后的胚胎可将受精卵或早期胚胎移入同种或异种动物的胚胎，该方法没有种属特异性，但为了在培养后容

25、易找到胚胎和对胚胎的保护，一般先用琼脂包埋后再培养。 胚胎细胞计数法即空气干燥法和荧光染色法。 空气干燥法是将胚胎放入1柠檬酸钠溶液中低渗1020分钟，尽量少带液体，将胚胎吸到洁净载片上，再用固定液固定。空气干燥后，经Giemsa染色、计数。 荧光染色法可以广泛应用于牛、羊、仓鼠、小鼠、兔子、猪等胚胎计数，常用的染料有Hoechest 33342，复染液为用2.3柠檬酸钠配制的0.1或0.01的台盼蓝（TB）液。7.32胚胎移植胚胎移植（embryo transfer，ET）一般是针对早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宫中取出，经过人为处理，可以再送入子宫的过程，这胚胎生物工程的基

26、本技术。同期发情胚胎移植时，供体胚胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情（oestrus ynchronization），包括自然同期发情和人工同期发情。 自然同期发情即不经任何药物处理，依靠动物自身的性周期规律，选择处于适当时期的母畜作为受体。 实际操作中，多用性激素进行人工同期发情。 以小鼠为例，将自然排卵或人工超排的小鼠与结扎输精管的公鼠交配，造成假孕。子宫移植时，一般选用假孕2.5天的母鼠。胚胎的活力 的检测形态学标准进行检测 ：首先看胚胎的外形，要求形态正常，卵裂球均一，透明带完整。其次要鉴别采卵时间是否与胚胎发育时期相吻合。如果发育时间落后于采

27、卵时间，则胚胎本身可能有问题。 也可以用0.5的台盼蓝对胚胎做染色处理，活细胞是不被着色。一般有一半以上卵裂球着色的胚胎发育能力较差。胚胎移植移植分为手术移植和非手术移植，在无菌条件下，向输卵管或子宫内用微吸管将吸入的胚胎注入，在小鼠、大鼠和仓鼠都应在动物背部开口，找出输卵管将胚胎移入 向子宫内移植多在囊胚期，成功率较高，在小鼠和大鼠，可达到7080。 羊和猪一般是开腹进行手术移植，在牛，目前多进行非手术移植。手术法移植手术法是指将动物保定、全身麻醉或局部麻醉后，清理手术部位。 在背部或腹中线开口，将输卵管或子宫拉出体外。 如果进行输卵管移植，把吸好胚胎的移植管由输卵管伞口插入管内，尽量插得深

28、一些。然后把胚胎吹入输卵管内。移植时，应尽量少带入液体。 如果进行子宫移植，在离子宫角与输卵管接合部约5cm处，先用钝头针扎一小孔，随即抽出，把移植管顺此孔插入子宫腔，吹入胚胎。复位、缝合。 手术法一般是移植卵裂早期的胚胎。牛胚胎移植用人工受精管，通过子宫颈进入子宫体，然后注入胚胎7.33胚胎保存保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。 非冷冻保存是1948年，由M.C.Chang 等开创的，他们将兔2细胞胚胎，在同种血清中37保存48小时，移植后产仔。 非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37保存法和冷藏保存法又称为中间受体培养法，是指把一种动物的胚胎，移入另一种动物的

29、输卵管或子宫内，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的动物都能在另一种动物的输卵管或子宫内存活的。 琼脂包埋移植法是指将胚胎移植到1的琼脂液中，用口径适宜的微吸管把胚胎连同少量琼脂液一起吸入。当琼脂凝结后再将其压出，胚胎就被封入圆柱形琼脂小柱中，每个琼脂小柱放35枚胚胎，再把这个琼脂小柱封入较大的1.2琼脂圆柱内。然后，通过胚胎移植技术，将琼脂柱移入中间受体输卵管中。移植前，预先结扎输卵管与子宫的接合部。 直接移植法是不经琼脂处理，直接移入预先结扎过的受体输卵管中。经过短期培养后，将胚胎从输卵管内冲出 ，观察发育情况。对发育良好者，移植入同期发情的同种动物受体内，使其产仔。异种动物体内保存法3

30、7保存法是指在37下，短时间保存卵和胚胎。 由于是在胚胎培养的条件下进行，因而应当考虑到保存时间和胚胎发育、卵老化等问题。 例如，兔和小鼠的46细胞胚胎，经过96小时在37保存，已经发育到胚泡阶段。一般而言，经过48小时体外保存，再移向受体，胎儿的发育率要下降50，保存时间越长发育率越下降。 就卵母细胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存时间长，即或能受精，也可能出现胚胎发育异常。冷藏保存法 低于室温，但还达不到冷冻阶段的温度对胚胎进行保存即为冷藏保存法，一般在010左右保存。 由于低温，可以抑制物质代谢的速度和细胞分裂的速度，因之可以延长保存时间 。冷冻法冷冻法是指196保

31、存胚胎，在进行超低温冷冻前，必须进行冷冻保护剂处理。一般说来，在80以上时，细胞则逐渐失去活力，到130以下，细胞内的水分呈微细冰晶样或玻璃样结构，细胞内所有需要能量的反应停止，细胞的活动也几乎停止。 最早，小鼠中获得成功。冷冻过程中细胞受到的损害在冷冻过程中，细胞会受到两方面的损害。 快速冷冻时，细胞内形成的冰晶，对细胞膜和内部结构产生机械性损害，这是指冷冻的物理损伤。 当缓慢降温时，细胞内的水，有足够的时间完全渗到外面，从冰点缓慢降到细胞完全脱水，往往需要几个小时或更长时间，细胞一直处于高浓度溶质中。如不加抗冷冻剂，细胞也会受到损害，这是冷冻的化学损伤。防止冷冻损伤在冷冻液中，可以加入冷冻

32、保护剂，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。 冷冻保护剂的加入，可保护细胞抵抗低温对细胞产生的损害。在胚胎冷冻过程中，还需要在稍低于溶液冰点时，强行致冷，防止溶液过冷现象的发生，这种促使溶液结冰的方法称为诱发结晶或植冰（seeding）。一般，在37之间诱发结晶。 现在，人们已经使用玻璃化法冷冻胚胎获得成功，在冷冻保存液中加入高浓度的冷冻保护剂，使溶液粘性增强，当处于超低温时，形成玻璃样液体。动物胚胎的一般保存程序动物胚胎的一般保存程序是将胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷却到0，逐渐加入冷冻保护剂，封闭安瓿。然后，把封闭好的安瓿从0冰室，转移到5-6的恒冷室中，用预先在液

33、氮凹面冷却的眼科镊子尖部，接触安瓿，玻璃上一出现霜，就立即移开镊子，完成植冰过程，之后，慢速冷至40或70，再直接投入液氮中保存超低温冷冻保存方法慢速冷冻、慢速解冻法是最早建立起来的哺乳动物胚胎冷冻方法。 以低于1/分钟的速度降低到40或70（小鼠）、60120(牛)、80（卵母细胞），再投入液氮。解冻速度也不超过25/分钟。其优点是脱水完全，细胞内不易形成冰，但比较费时，冷冻保护剂对胚胎作用时间长。 快速冷冻、快速解冻法是指把胚胎慢速降温到3035，投入液氮。解冻可以在室温或37水浴中进行。该方法能较好地克服胚胎脱水少细胞内冰晶形成之间的矛盾，获得较高的存活率。解冻后，用蔗糖洗脱。超低温冷冻

34、保存方法一步冷冻法省去了洗脱冷冻保护剂，其主要特点是冷冻细管里的冷冻液和稀释液是分开的。细管里装有培养液、含胚胎的冷冻液、稀释液。该法适用于冷冻胚胎运输使用。 快速冷冻法将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。 玻璃化法简单、快速而有效，不需要冷冻仪，主要依靠溶液的玻璃化特性，将卵母细胞或胚胎同玻璃化液处理，然后直接投入液氮，解冻时快速进行。牛胚胎冷冻家畜胚胎冷冻以牛胚胎最为成功，添加牛血清或牛血清白蛋白的杜氏PBS，一直被广泛用于胚胎保存的基础液 。采用慢速冷冻、快速冷冻、一步法冷冻、玻璃化法，均可成功。 甘油比DMSO更有利于牛胚胎冷冻。 牛胚胎冷冻已经广泛应

35、用于商业性胚胎移植工作。7.34胚胎分割 同卵双生胚胎分割的原理根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。 胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。卵裂球分离培养卵裂球分离培养是将桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明带，分离每个卵裂球，将其包埋于琼脂中，将包有卵裂球的琼脂柱，移到中间受体小鼠或兔的输卵管中，经数日活体内培养后，再取出已经发育到多细胞的胚胎，移于受体子宫。 这种方法已经在牛、羊、马生出同卵多胎。 对研究卵裂球位置与分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂

36、球遗传性等，都是一种很有用的技术。致密化以前各期的胚胎分割对于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之间彼此尚未建立起紧密联系，分割时较容易进行。根据胚胎的直径，制作适宜口径的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。在显微操作仪上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃针自上而下切开透明带，使其成为一个切口。将微吸管自切口处伸入，吸住半数卵裂球，慢慢取出，这样即可以把胚胎一分为二。把吸出的半胚或卵裂球，纳入空透明带中。空透明带是将废弃的卵母细胞或不合适的胚胎，去除其内容物即可。然后将分割后的胚胎包入琼脂柱，通过中间受体培养。依照同样的方法，可以将胚胎分割成为四或八分胚桑椹期的胚胎分割用微玻璃针或微刀进行分割，无

37、需固定吸管，由于透明带韧性较强。 切割之前需要对其进行软化处理，处理标准是：48细胞胚胎用0.5酶液处理12分钟；桑椹胚用0.20.3酶液处理30秒钟；囊胚则用0.20.3酶液处理30秒以下。过程把经过软化处理的胚胎，与少量培养液一起置于载片上，把针或微刀的刃部调节到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，继续下切，胚胎就被压扁，继而被切开。再把切割的胚胎纳入空透明带。 囊胚切割时，需将内细胞团一分为二，早期的囊胚的二分胚发育率，比桑椹胚的二分胚发育率要低，可能是因为囊胚正处于进一步的细胞分化状态，操作后胚胎的调整能力比桑椹胚差。相对而言，二分胚、四分胚比较容易培养，而八分胚

38、的存活率很低。过程 胚胎分割7.35胚胎嵌合嵌合体（chimera）是指在同一个体中，由于基因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并存的状态 发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体称为原发性嵌合体，而把在发育的较晚期，如胚层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合，称为次生性嵌合体1901年，Spemann最早开始进行动物嵌合体的研究，他进行了蛙嵌合个体的培育，其目的是为了研究两栖类动物的发育机制。 1960年，Mintz开始研究嵌合体制作技术，到1965年第一次获得活至成体的正常小鼠嵌合体。植入前胚胎嵌合体的制作方法聚合法 第一种可以利用胚胎与胚

39、胎聚合，即使用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液（pH2.5）或0.5链霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有5g/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和PHA的作用，更易聚合。若放到37时，效果更佳，聚合完毕后，洗除PHA，继续培养，或进行胚胎移植。 第二种是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助PHA的作用使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。 第三种利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细胞或卵裂球，放入空透明带内，用PHA使之聚合在一起，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观察其发育的情况。囊胚注射法囊胚注射法是把某些种类细胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已