【生物课件】 哺乳动物克隆技术(08-08-25)

1、第七章 哺乳动物克隆技术 随着1997年2月Nature杂志报道英国Roslin研究所等人创造的克隆羊多莉(Dolly)诞生，生物工程掀开了新的一页。克隆(clone)一词原意为无性繁殖系，在体外培养的细胞中早有使用，细胞克隆是指由一个细胞经细胞分裂而产生出的一群细胞，而动物克隆是指由一个动物经无性繁殖而产生的遗传性状完全相同的后代个体。卵细胞供体羊Scottish Blackface sheepDollyDollyFinnDorset(Foster Mother, 寄母)核供体羊克隆羊“多莉诞生后，克隆技术研究立即成为世界各国生物学家竞相开展的生物学高新技术研究。克隆技术之所以一经产生立即引

2、起高度重视，是因为克隆技术不但具有重要的理论意义而且具有良好的应用前景。 第一节 哺乳动物克隆的开展历史讲授提纲第七章 哺乳动物克隆技术 第二节 哺乳动物克隆的技术方法第三节 克隆动物的早衰问题第四节 克隆动物的应用前景第一节 哺乳动物克隆的开展历史同种胚胎细胞克隆同种体细胞克隆异种体细胞克隆克隆动物技术的开展已经历了60余年的漫长探索，根据供体细胞核与去核卵细胞的来源可归纳为3个标志性的开展阶段。1938年，德科学家Hans Spemann最早提出克隆设想。1952年，美国科学家Briggs和King将发育后期的青蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中，没有发育。1965年，中国实验胚胎学家童第周完成了金

3、鱼核移植并获得成功。1981年，Illmensee和Hoppe用小鼠胚胎细胞第一次获得了克隆小鼠，但其实验未能被重复。第一个阶段 同种胚胎细胞克隆1984年，丹麦科学家Willadsen用胚胎细胞克隆羊获得成功。1990年，中国科学院发育生物学研究所杜淼获得了克隆兔。 随后，90年代，中国科学家利用胚胎细胞相继克隆成了兔、羊、猪、牛、小鼠等几种动物。1993年，美国的First用牛内细胞团细胞成功地获得了克隆牛。1997年，中国学者孟励在美国成功获得克隆猴。 至此，国内外动物克隆采用的均为胚胎细胞。1997年，孟励首次用胚胎细胞获得的克隆猴。1997年，英国罗斯林研究所等宣布用成年羊乳腺细胞首

4、次获得克隆羊。1998年，日本科学家Kato等用牛的输卵管细胞得到克隆牛。第二个阶段 同种体细胞克隆1998年，美国夏威夷大学的Yanagimachi等用克隆鼠的卵丘细胞核作供体，获得了克隆再克隆小鼠。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。1998年，新西兰成功地克隆了奶牛，并克隆了世界上仅存的最后一头珍稀牛。附：同种体细胞克隆研究现状1999年10月和2000年5月，我国扬州大学与中科院发育所合作用携带外源基因的体细胞克隆出转基因山羊。2000年6月，我国西北农业大学用体细胞克隆出山羊。2000年9月，美国科学家采用原核互换的两步核移植方法获世界首例克隆猪。2001年1月，美国麻省ATC公司克隆

5、出一只印度野牛。2002年初，世界上第一只克隆猫在美国诞生。2002年，世界上第一只克隆兔在法国诞生。2003年5月，世界上第一只克隆骡子在美国诞生。2003年8月，世界上第一只克隆马在意大利诞生。2002年初，我国首批成年体细胞克隆牛群体诞生。2002年初，在美国诞生的世界上第一只克隆猫。2002年，在法国诞生的世界上第一只克隆兔。2003年5月，在美国诞生的世界上第一只克隆骡子。2003年8月，在意大利诞生的世界上第一只克隆马。2002年初，在我国诞生的首批成年体细胞克隆牛。1998年1999年，美国人White用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合，韩国黄禹锡将白头山老虎体细胞核与牛卵结合，

6、我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期胚胎。 2001年10月,意大利科学家报道异种克隆濒危的欧洲盘羊获得成功。第三个阶段 异种体细胞克隆第二节 哺乳动物克隆的技术方法克隆动物主要方法：胚胎分割胚胎细胞核移植体细胞核移植连续细胞核移植优质动物体细胞的来源动物卵母细胞的成熟培养重构胚胚胎移植克隆动物检测体细胞核移植法克隆动物的大体操作流程卵母细胞核体细胞核核移植体外培养1、动物体细胞的体外培养G0期(细胞周期时相)常规体外培养降低血清使用量细胞分裂停止移核前卵丘卵母细胞复合体(COC)用M199洗3次100l成熟培养液成熟培养液： M199 +10% FCS +10 g/mL

7、 PMSG +10 g/mL HCG5%CO2，38.5，饱和湿度24h 或2830h观察卵丘扩展情况例:小牛卵母细胞的成熟培养养(IVM)2、卵母细胞的成熟培养盲吸法荧光法挤压法吸引法蔗糖法3、去核方法带下注射直接胞质内注射法4、核注射方法透明带应用piezo-pulse设备直接注射法常规法原核互换两步法孤雌活化协同法诱导法5、核移植方法将数枚重构胚放入100L的胚胎培养液CR1-aa中培养48h后，选择4细胞以上的胚胎移入铺满饲养层细胞 的培养液滴中。在120h半换液，148h参加1mg/mL的葡萄糖。以后每隔48h半换液。5、重构胚胎的体外培养小鼠胎儿成纤维细胞6、胚胎移植方法假孕的同步

8、发情的寄母输卵管内移植子宫角移植体细胞核卵母细胞重构胚移入同步发情的动物输卵管或子宫内体体体细胞克隆动物研究路线图图图体外培养去核胚胎移植移核7、克隆动物的检测方法微卫星图谱法同工酶法克隆牛“动动的微卫星检测结果(红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段)受胎率低26.2%流产率高(53.8%)克隆动物的存活率低35.7%)常出现早衰现象存 在 问 题第三节 克隆动物的衰老问题克隆羊“多莉出现了早衰现象，其端粒长度比正常出生的羊短了20%，这与供核羊Finn Dorset的6岁年龄直接相关。人类染色体端粒的荧光免疫原位杂交照片1999年，美籍华人杨向中教授第一个报道了克隆动物具有正常长度的端

9、粒和遗传年龄，得出克隆动物不会未老先衰、克隆动物的遗传年龄与供体动物年龄无关的结论。此后，这一结论被美国麻省的ATC公司在克隆牛上和美国洛克菲勒大学在克隆鼠上得到证实。总之，由于细胞衰老的分子机理至今仍未能研究清楚，因此有关克隆动物的衰老问题，目前仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。端粒酶结构的模式图解第四节 克隆动物的应用前景克隆动物在畜牧业和医学方面具有极为重要的意义，这不仅表现在理论研究方面，更重要的是其在应用开发方面的实用价值。1. 克隆技术能快速培育出大量的优良品种家畜，而用传统的有性生殖方式培育动物良种不但需要花费很长的时间，而且优良性状难以在后代得到控制。克隆动物在畜牧业和医学方面的意义表达在：2. 克隆动物的遗传背景完全一致，因而可以防止动物实验的背景干扰，如用在药物检测上，所得结果将更加稳定可靠。3. 动物克隆技术可以用来保护濒危动物，用濒危动物的冷冻细胞随时可以克隆出新的成体动物，而无须消耗大量的人力物力。克隆动物可为需要组织器官移植的病人提供所需要的组织器官。 国外已经开始了这方面的研究，例如科罗拉多大学的研究者用来源于克隆牛胎儿的多巴胺生成细胞治疗帕金森氏病模型大鼠，已取得一定效果。治疗性克隆示意图5、动物克隆技术 如果与 转基因