生化物质的制备和分离纯化技术

1、生化物质的制备和分离纯化技术思考题（课前设疑）1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件下容易变性？3.在制备生化物质前应如何选择原料？ 5.对酸性物质的提取，常在什么条件下进行？对碱性物质的提取，常在什么条件下进行？对两性物质的提取，常在什么条件下进行？6.以细丙为例解释提取制备每步的基本原理？4.什么叫动态吸附和静态吸附？它们在应用上有何区别？ 一般从天然生物材料制作生化物质的过程大体可分为六个阶段： 1.原料的选择和预处理 2.原料的粉碎； 3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品 的工艺过程； 4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、

2、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程； 利用生化制备技术从生物材料中获得特殊的生物活性物质，如蛋白质、酶、激素、核酸等生化产品时，通常要注意以下几个问题： 6.成品及.制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。5.干燥及保存；1生物材料的组成成分非常复杂，有数百种甚至更多，各种化合物的形状、大小、相对分子质量和理化性质都各不相同，有的迄今还是未知物，而且这些化合物在分离时仍在不断的代谢变化中。 2在生物材料中，有些化合物含量很低或极微，有的只有1l0 000，甚至更少。制备时，原材料用量很大，得到产品很少，与投料量相比“虎头

3、蛇尾”。近年来，用所谓“钓鱼法”，利用某些分子特有的专一亲和力，将某一化合物从极复杂的体系中“钓”出来，与其他化学分离技术相比具有很大的优越性。 3许多生物活性物质，一旦离开了生物体内环境，很易变性及被破坏，应十分注意保护这些化合物生物的活性，常选择十分温和的条件，尽可能在较低温度和洁净环境中进行。一般来说制备的操作时间长、手续较繁琐。因为许多大分子在分离过程中，过酸、过碱、重金属离子、高温、剧烈的机械作用、强烈的辐射和机体内自身酶的作用，均可破坏这些分子的结构或生理活性。 4生化分离制备过程几乎都在溶液中进行，各种温度、pH、离子强度等参数，对溶液中各种组成的综合影响，常常无法固定，有些实验

4、或工艺的设计理论性不强，常带有很大的经验成分。因此，要建立重复性好的成熟工艺，对生物材料、各种试剂及其辅助材料等都要严格地加以规定。 5生化制备方法最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，这是由于生物分子对环境反应十分敏感，结构与功能的关系比较复杂，评定其均一性时，要通过不同角度测定，才能得出相对“均一性”结论，只凭一种方法所得纯度的结论，往往是片面的，甚至是错误的。原料选择和预处理 选什么样的原材料应视生产目的而定。一般要注意以下几个方面: 1要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2来源丰富易得； 3制造工艺简单易行； 4成本比较低； 5经济效果要好。 如蛋白质原料的选择 蛋白质类生化产

5、品的原料来源有动植物组织和微生物等，原则是要选择富含所需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提取的无害生物材料。 对天然蛋白质生化产品，为提高其质量、产量和降低生产成本，对原料的种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞都有一定的要求，了解这些，可使分离纯化工作事半功倍，反之则收效甚微。 1种属 牛胰含胰岛素（isulin)单位比猪胰高，牛为4000 IUkg胰脏，猪为3000 IUkg胰脏。抗原性则猪胰岛素比牛胰岛素低，前者与人胰岛素相比，只有1个氨基酸的差异，而牛有3个氨基酸的差异。 2发育生长阶段 幼年动物的胸腺比较发达，老龄后逐渐萎缩，因此胸腺原料必须采自幼龄动物

6、。 3生物状态 动物饱食后宰杀，胰脏中的胰岛素含量增加，对提取胰岛素有利，但胆囊收缩素的分泌使胆汁排空，对胆汁的收集不利。严重再生障碍性贫血症患者尿中的EPO（erythropoietin,红细胞生成素）含量增加。 4原料来源 血管舒缓素可分别从猪胰脏和猪颚下腺中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以颚下腺来源为好，因其不含蛋白水解酶。 5原料解剖学部位 猪胰脏中，胰尾部分含激素较多，而胰头部分含消化酶较多。如分别摘取则可提高各产品的收率。 胃膜素以采取全胃粘膜为好，胃蛋白酶(pepsin)则以采取胃底部粘膜为好，因胃底部粘膜富含消化酶。 6.从简化提纯步骤着手 如从鸽肝中提取乙酰化酶，需将

7、动物饥饿后取材，可减少肝糖原，以简化纯化步骤。7对生物技术产品宿主菌或细胞的要求 选择生物技术产品的宿主受体菌或细胞也应考虑到后处理的问题。如用大肠杆菌表达，由于其不能将所表达的蛋白质分泌到体外，故提取时必须破壁，增加了提取的困难，而且还可能含有毒素类有害因子；用枯草杆菌 用肿瘤细胞作宿主细胞制成的生化产品还应考虑到其安全性，制造体外诊断用试剂则是很好的高产方法。或酵母菌作宿主菌，虽可解决这一矛盾，但表达的蛋白质成分仍有缺乏糖基化等翻译及修饰的缺陷；用动物细胞和昆虫细胞表达则能比较好地解决后处理及完整表达的问题。原料的粉碎 在提取前先将大块的原料粉碎或绞碎成适用的粒度，或将细胞破碎，使胞内生物

8、活性物质充分释放到溶液中，有利于提取或吸附。不同的生物体或同一生物体不同的组织，其破碎的难易不一样，使用的方法也不完全相同。动物的脏器组织，常用绞肉机机械法粉碎；植物肉质组织可以磨碎；许多微生物均具有坚韧的细胞壁，常用自溶、冷热交替、加砂研磨、超声波、加压处理等破碎方法。如果提取的有效成分是体液或细菌胞外某些多肽激素、酶等，则不需要破碎细胞。 主要通过机械力的作用，使组织粉碎。粉碎少量原料时，可使用高速组织捣碎机（10 000rmin）、匀浆器、研钵、研船等。工业生产上一般常用的粉碎设备有电磨机、球磨机、万能粉碎机、绞肉机、击碎机等。 一、机械法 二、物理法1.反复冻融法 把待破碎的样品冷至1

9、520，使之凝固，然后缓慢地溶解，如此反复操作，大部分动物性的细胞及细胞内的颗粒可以破碎。 在细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。操作时，将材料投入沸水中，在90左右维持数分钟，立即置于冰浴中，使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 2.冷热交替法 3超声波处理法 多用于微生物材料，处理的效果与样品浓度、使用频率有关。用大肠杆菌制备各种酶时，常用50100mgL菌体的浓度，在1KHz10KHz（千赫兹）频率下处理1015min。对于其他细菌，则视具体情况而定。操作中注意避免溶液中气泡的存在，制备对超声波敏感的一些核酸、酶，要慎重使用。 4.压破碎法 加气压或水压（如上海高压匀浆泵厂生产的高压匀

10、质机），达34.32（兆帕）MPa（210350kgfcm2）的压力时，可使90%以上细胞被压碎。多用于微生物酶制剂的工业制备。 三、生化及化学法 1自溶法 即新鲜的生物材料存放在一定的pH和适当温度下，利用组织细胞中自身的酶系将细胞破坏，使细胞内含物释放出来的方法。自溶的温度，动物材料选在04，微生物材料则多在室温下进行。 自溶时，需加少量的防腐剂，如甲苯、氯仿等，以防止外界细菌的污染。因自溶的时间较长，不易控制，故制造具有活性的核酸、蛋白质时比较少用。2酶处理法 用外来酶处理生物材料，如溶菌酶（Lysozyme）是专一地破坏细菌细胞壁的酶。如用噬菌体感染大肠杆菌细胞制造DNA时，采用pH8

11、的L三羟甲基氨基甲烷（Tris）L乙二胺四乙酸（EDTA）制成每毫升含2亿个细胞的细胞悬液，然后加入100g 1mg的溶菌酶，在37保温10min，细菌胞壁即被破坏；还有把蜗牛酶用于酵母细胞的破碎；用胰酶处理猪脑制备脑安素。用于专一性分解细胞壁的酶还有纤维素酶（破坏植物细胞）、细菌蛋白酶、酯酶、壳糖酶等。 3.表面活性剂处理法 表面活性剂的分子中，兼有亲脂性和亲水性基团，能降低水的界面张力，具有乳化、分散、增溶作用。较常用的有十二烷基硫酸钠(SDS)、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。 生化物质的提取 利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程称为提取（extrac

12、tion），提取又称萃取或抽提，其含义基本相同。用冷溶剂从固体物质提取的过程可称为浸渍（maceration）；用热溶剂者可称为浸提（digestion），也称浸煮 一、物质的性质与提取（一）物质的性质与提取方法的选择 选择合适的溶剂系统与提取条件。 （二）活性物质的保护措施 1采用缓冲系统 2添加保护剂（半胱氨酸，还原性谷胱甘肽等） 3抑制水解酶的作用(SDS,EDTA) 4其他保护措施(避免过酸过碱和剧烈搅拌 ）（三）生化物质的提取 一般生产上多用23次提取。溶剂用量（L）为生物材料的25倍，少数情况也有用1020倍量溶剂作一次性提取。目的是节省提取时间，降低有害酶的作用。 二、影响提取的

13、因素 （）温度（二）酸碱度 （三）盐浓度 四、提取方法 （）用酸、碱、盐水溶液提取（二）用表面活性剂提取（三）有机溶剂提取 对酸性物质的提取，常在碱性条件下进行；对碱性物质的提取，常在酸性条件下进行；对两性物质的提取，则使水溶液的pH值在该两性物质的等电点附近为佳。三、超临界气体的萃取技术 以气体为萃取剂，当气体处于超过临界温度和临界压力时，呈现一种既非液相又非气相的流体，兼有液体和气体的特性。如密度接近于液体，粘度却接近于气体，具有良好的溶剂性质。 气体萃取剂必须具有临界压力低，临界温度接近于室温，化学稳定性好，价廉易得等特点。主要有二氧化碳、氮气、乙烯、乙烷、丙烯、丙烷等，最常用的是二氧化

14、碳。其方法主要有等温法和等压法两种，借助于压力或温度的调节分离萃取剂与被萃取物。 该技术应用于酶、不饱和脂肪酸的提取（如鱼油和卵磷脂的提取）、精制和回收，也可用于生化产品的溶剂脱除。某些生化产品在生产过程中，采用了丙酮和甲醇溶剂，欲脱去溶剂又要避免产品的分解，需选择超临界气体提取。与减压干燥法相比较，前者不多消耗能源，且缩短脱溶时间。 五、提取液的分离 提取所得到的溶液，需与固体或另一液体分离。溶液与固体的分离，一股处理方法有三种：自然沉降、过滤、离心。自然沉降是在液体介质中，固体自然下沉而分离的过程。当混悬液处理量较大，且固体和液体的比重悬殊时，可用此法。沉降分层后，可用虹吸等方法将液体部分

15、移去。过滤系利用多孔材料阻留固体，而使液体 通过，达到固体与液体分离的过程。离心是利用旋转运动的离心力进行分离物料的一种操作，其中通过过滤介质分离液体和固体者为离心过滤；利用液体比重的大小分离出不同比重的液体者为离心分离；利用液固两相比重的差异进行沉降分离者为离心沉降。生化物质的分离纯化技术 生化物质分离纯化技术包括：生化产品的分离分析和生化产品的制备。前者主要对生物体内各组份加以分离后进行定、定量鉴定，它不一定要把某组分从混合物中分离提取出来；而后者则主要是为了获得生物体内某一单纯组分。 为了保护目的物的生理活性及结构上的完整性，生物产品的制备中的分离方法多采用温和的“多阶式”方法进行，即常

16、说的“逐级分离”方法。为了纯化一种生化物质常常要联合几个，甚至十几个步骤，并不断变换各种不同类型的分离方法，才能达到目的。因此操的时间长，手续繁琐，给制备工作带来众多影响。亲和层析法具有从复杂生物组成中专一的“钓出”特异生化成分的特点，目前已在生物大分子，如酶、蛋白、抗体和核酸等的纯化中得到广泛应用。一 分离纯化原理 （1）根据分子形状和大小不同进行分离。如差速离心与超离心，膜分离（透析、 电渗析）与超滤法，凝胶过滤法。 （2）根据分子电离性质（带电性）的差异进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。 （3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离。如溶剂提取法，逆流分配法，分配层析法，盐析法，

17、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。（4）根据物质吸附性质的不同进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。 （5）根据配体特异性进行分离亲和层析法。二 分离纯化的程序和生产设计（1）确定制备物的研究目的及建立相应的分析鉴定方法；（2）制备物的理化性质稳定性的预备试验；（3）材料处理及抽提方法的选择； （4）分离纯化方法的摸索； （5）产物的均一性测定。 1分离纯化初期使用方法的选择 早期分离纯化用萃取，沉淀，吸附等一些分辨力低的方法较为有利，这些方法负荷能力大，分离量多兼有分离提纯和浓缩作用，为进一步分离纯化创造良好的基础。 早期分离方法的选择原则是从低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大者为合适，但

18、随着许多新技术的建立，一个特异性方法的分辨力愈高，便意味着提纯步骤愈简化，收率愈高，生化物质的变性危险愈少，因此亲和层析法，纤维素离子交换层析法、连续流动电泳、连续流动等电聚焦等在一定条件下，也用于从粗提取液中分离制备小量目的物。2各种分离纯化方法的使用程序 生化物质的分离都是在液相中进行，故分离方法主要根据物质的分配系数，分子量大小，离子电荷性质及数量和外加环境条件的差别等因素为基础。 例如纯化其一两性物质时，前一步已利用该物质的阴离子性质，使用了阴离子交换层析法，下一步提纯时再应用其阳离子性质作层析或电泳分离便会取得较好分离效果。 如有些杂质在各种条件下带电荷性质可能与目的物相似，其分子形

19、状与大小与目的物相差较大，而另一些杂质的分子形状与大小可能与目的物相似，但在某条件下与目的物的电荷性质不同，在这种情况下，先用分子筛，用离心或膜过滤法除去分子量相差较大的杂质，然后在一定pH值和离子强度范围下，使目的物变成有利的离子状态，便能有效地进行色层析分离。 在安排纯化方法顺序时，还要考虑到有利于减少工序，提高效率，如在盐析后采取吸附法，必然会因离子过多而影响吸附效果，如增加透析除盐，则使操作大大复杂化。如倒过来进行，先吸附，后盐析就比较合理。 3分离后期的保护性措施 在分离操作的后期必须注意避免产品的损失，主要损失途径是器皿的吸附，操作过程样品液体的残留，空气的氧化和某些事先无法了解的

20、因素。为了取得足够量的样品，常常需要加大原材料的用量，并在后期纯化工序中注意保持样品溶液有较高的浓度，以防制备物在稀溶液中的变性，有时常加入一些电解质以保护生化物质的活性，减少样品溶液在器皿中的残留量。三 分离纯化方法的评估 每一个分离纯化步骤的好坏，除了从分辨能力和重现性两方面考虑外，还要注意方法本身的回收率，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。一般经过56步提纯后，活力回收在25以上。但不同物质的稳定性不同、分离难易不同，回收率也不同。 对每一步骤方法的优劣的记录，体现在所得产品重量及活性平衡关系上。这一关系，可通过每一步骤的分析鉴定求出。例如酶的分离纯化，每一步骤产物重

21、量与活性关系，通过测定酶的比活力及溶液中蛋白质浓度的比例。其他活性物质也可通过测定总活性的变化与样品重量或体积与测出的活力列表进行对比分析，算出每步的提纯倍数及回收率。 四 生化产品纯度的鉴定 一个制备物是否纯，常以“均一性”表示。均一性是指所获得的制备物只具有一种完全相同的成分，均一性的评价常须经过数种方法的验证才能肯定。有时某一种测定方法认为该物质是均一的，但另一种测定方法却可把它分成两个甚至更多的组分，这就说明前一种鉴定方法所得的结果是片面的。如果某物质所具有的物理、化学等方面性质经过几种高灵敏度方法的鉴定都是均一的，那么大致可以认为它是均一的。当然，随着更好的鉴定方法的出现还可能发现它

22、不是均一的。绝对的标准只有把制备物的全部结构搞清楚，并经过人工合成证明具有相同生理活性时，才能肯定制备物是绝对纯净的。 生物分子纯度的鉴定方法很多，常用的有溶解度法，化学组成分析法，电泳法，免疫学方法，离心沉降分析法，各种色谱法，生物功能测定法，以及质谱法等。细胞色素C的制备与测定 细胞色素C的性质 细胞色素（Cytochrome）是包括多种能够传递电子或能够激活氧的含铁蛋白质的总称，广泛存在于自然界，在各种动物，植物组织和微生物中都能找到。在生物氧化过程中，细胞色素是重要的呼吸传递体。细胞色素C（Cytochrome C）又称细胞色素丙，简称细丙。主要存在于线粒体中，需氧多的组织含细胞色素C

23、最多，如心肌及酵母细胞的细胞色素C含量比一般组织细胞的高。所以制备中多采用心肌和酵母作为提取分离细胞色素C的原料。 细胞色素C是含铁卟啉的结合蛋白质。铁卟啉和蛋白质部分的比例为1:1。由碳、氢、氧、氮、硫、铁6种元素组成。牛、马、猪、人心的细胞色素C蛋白质部分均由104个氨基酸组成，其中只有数个氨基酸不同，氨基酸中含有较多的精氨酸，故呈盐基性。猪心肌的细胞色素C含铁量为 ，相对分子质量12200，等电点pI为。细胞色素C的结构中的辅基通过卟啉环上乙烯基的-碳和酶蛋白的一SH基按1:1连接成硫醚键，其连接方式见下图。 图 细胞色素C的结构式 细胞色素C溶于水，易溶于酸性溶液，故可自酸水中提取。它

24、可分为氧化型和还原型两种。细胞色素C的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应。 R 一Fe3+ RFe2+ 氧化型细胞色素C 还原型细胞色素C 这里R代表细胞色素C分子中铁原子以外的卟啉蛋白部分。从以上反应式可见，当细胞色素C分子中的铁原子为三价时(Fe3十)，是氧化型的，但接受一个电子后变成二价铁（Fe2+），成了还原型的细胞色素c分子，电子一旦给出后又成了氧化型的。两者在水溶液中的颜色明显不同：其氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。细胞色素C对热较稳定，不易变性，在时，加热至100 3min，变性才1828%。对酸碱比较稳定，可抵抗L HCl和的长时间处

25、理。但三氯醋酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。其还原型较氧化型稳定，不易与一氧化碳（CO）、氰化钾（KCN）结合，故一般都制成还原型，比较稳定，易保存细胞色素C溶液容易染菌，故需加少量氯仿和低温保存，亦可保存于硫酸铵溶液中或加4倍量冷丙酮沉淀制成冻干粉末，可保持活性数年。细胞色素C的临床作用 细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠正其物质的代谢，使细胞恢复正常呼吸，病情得到缓解或痊愈。细胞色素C目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。如用细胞色素C治疗脑血管障碍、脑软化、脑出血、中风后遗症、脑动脉硬化症、脑外伤、婴幼儿百日咳、脑病、不可逆休克期缺氧、脑栓塞、脑震荡后遗症、乙型脑炎的神经精神症状、心代偿不全、心肌炎、狭心症、白喉心肌炎、肺心病、心绞痛、心肌梗塞、肺炎、肺癌、硅肺、喘息、肺气肿及支气管扩张引起的呼吸困难、一氧化碳中