愈伤组织培养

1、第第2 2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养第第2 2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养本章主要内容：本章主要内容：v愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的诱导与分化v愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养v愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 不定芽和根的发生不定芽和根的发生 体细胞胚的发生体细胞胚的发生v愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用 1、了解愈伤组织细胞分化的各时期的、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点特点 2、掌握植物激素控制理论、掌握植物激素控制理论 3、掌握愈伤组织的形态发生、掌握愈伤组织的形态发生 4、区别胚状体发生途径与器官发生途、区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株径形成植株 5、愈

2、伤组织培养在园艺植物育种中的、愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用应用本章教学目的与要求 定义定义:是指将外植体接种到人工培养基是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。生长和分化的培养过程。愈伤组织培养愈伤组织培养(callus culture)第一节第一节 愈伤组织的诱导和分愈伤组织的诱导和分化化 一一 愈伤组织的诱导愈伤组织的诱导 诱导愈伤组织的关键主要是诱导愈伤组织的关键主要是培养条件培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因其中激素的成分和浓度是最重要的因素。素。Callus arising from le

3、af tissueCallus arising from vascular tissue From rootFrom embryo culturePhoto indicating where the callus (c) arises from Wound callus on the stemof an Erythrina tree 刺桐树刺桐树第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化二愈伤组织的分化二愈伤组织的分化 从外植体脱分化形成从外植体脱分化形成典型的典型的愈伤组织大致愈伤组织大致可分为三个时期：可分为三个时期：愈伤组织分化愈伤组织分化诱导期诱导期分裂期分裂期分化期分化期S

4、tage 1. Induction（诱导期）（诱导期）: 细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点。细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点。诱导期细胞内发生的变化诱导期细胞内发生的变化 气体交换增加，如氧气的吸收增加气体交换增加，如氧气的吸收增加 RNA含量增加（增加到含量增加（增加到300%） 蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%） 酶活性增强酶活性增强Stage 2. Cell division 分裂期分裂期 指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。增生子细胞的过程。p 1.1.细胞的细胞的数目

5、迅速增加数目迅速增加。p 2.2.每个细胞每个细胞平均鲜重下降平均鲜重下降。p 3.3.细胞体积小，内无液泡细胞体积小，内无液泡。p 4 4细胞的核和核仁增大到最大。细胞的核和核仁增大到最大。p 5.5.细胞中细胞中RNARNA含量减少，而含量减少，而DNADNA含量保持不含量保持不变变。p 6. 6. 随着细胞不断分裂和生长，随着细胞不断分裂和生长，细胞总干细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快合成极快。分裂期细胞的主要表现分裂期细胞的主要表现: 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状

6、态，颜色浅而透明。维持其不分化的状态，颜色浅而透明。1mg/l 2,4-D10mg/l 2,4-D分裂期愈伤组织的共同特征：分裂期愈伤组织的共同特征：Stage 3. Differentiation 分化期分化期 指愈伤组织细胞停止分指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化态和生理上的变化, ,形成一形成一些不同形态和功能的细胞些不同形态和功能的细胞的时期。的时期。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化A A 细胞分裂部位和方向发生改变细胞分裂部位和方向发生改变：B B 形成瘤状或片状形成瘤状或片状的的分生组织结节分生组织结节。或。或维管组

7、织结节。维管组织结节。C C 细胞的体积相对稳定，不再减少。细胞的体积相对稳定，不再减少。D D 出现了各种类型的细胞出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞分生细胞、色素细胞等。等。E E 生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的老化的多转化为黄色或褐色多转化为黄色或褐色。第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化分化期细胞特点：分化期细胞特点：Callus types： Friable易碎易碎 Hard / lignified callus Rhizogenic callu

8、s生根的愈伤生根的愈伤 Callus exuding sticky poly-saccharides渗出粘性多糖的愈伤渗出粘性多糖的愈伤 根据愈伤质地划分为：根据愈伤质地划分为：第一节愈伤组织的诱导和分化第一节愈伤组织的诱导和分化Callus may have a yellow, white, green or red (anthocyanin 花青苷花青苷) appearance. 不同颜色的愈伤不同颜色的愈伤第二节第二节 愈伤组织的继代愈伤组织的继代培养培养1 1、定义：定义：培养物在培养基上生长一段培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失

9、，以及代谢产物的积累，必分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养须转移到新鲜培养基上培养, ,这个过这个过程叫做程叫做继代培养继代培养。2、愈伤组织培养的调控因素：、愈伤组织培养的调控因素：外植体外植体培养基培养基培养环境培养环境第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养（一）材料本身（一）材料本身第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养年龄年龄器官和部位器官和部位遗传型遗传型外植体外植体 1 1无机营养无机营养 培养基中的培养基中的N N，大多数都用硝态氮，对，大多数都用硝态氮，对细胞分化起重要作用。细胞分化起重要作用。 2 2植物生长调节物质植物生长调节物质 一

10、般使用的浓度为一般使用的浓度为0.1-10mg0.1-10mgL L。 使用植物生长调节剂时，要注意使用植物生长调节剂时，要注意种类种类和浓度和浓度，特别是生长素和细胞分裂素，特别是生长素和细胞分裂素的比值。的比值。 第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养（二）培养基（二）培养基器官分化的植物激素控制理论器官分化的植物激素控制理论(激素配比模式激素配比模式) 生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向成的控制条件，决定着发育的方向: :是愈是愈伤组织、长根还是长芽。伤组织、长根还是长芽。 高高 利于根的形成利于根的形成生长素生长

11、素/细胞分裂素细胞分裂素 适中适中 利于愈伤组织的形成利于愈伤组织的形成 低低 利于芽的形成利于芽的形成第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养愈伤组织分化愈伤组织分化第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养 培养基中加入培养基中加入糖、各类糖、各类B B族维生素、肌醇族维生素、肌醇和甘氨酸和甘氨酸等，等，可满足愈伤组织生长和分化可满足愈伤组织生长和分化的要求的要求。 各种各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可促进可促进器官分化。器官分化。 水解酪蛋白水解酪蛋白中含有多种氨基酸，中含有多种氨基酸，助于器官助于器官分化分化 酰胺类酰胺类往往有往往有促进器官形成促

12、进器官形成的作用。的作用。第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养3有机成分有机成分第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养4.培养方式：培养方式：固体培养固体培养液体培养液体培养（三）培养条（三）培养条件件第二节愈伤组织的继代培养第二节愈伤组织的继代培养光照光照温度温度24-28光强、光照时间、光质光强、光照时间、光质第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 形态建成形态建成：外植体细胞在适宜的培养：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。完整植株

13、。魔芋胚状体魔芋胚状体小麦愈伤组织小麦愈伤组织第第2章章 愈伤组织培养愈伤组织培养愈伤组织的形态发生方愈伤组织的形态发生方式式: :不定芽方式不定芽方式胚状体方式胚状体方式第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(1,2-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)一、不定芽方式（一、不定芽方式（adventitious bud）第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生愈伤组织的器官发生顺序有四种愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：情况： （1）

14、愈伤组织仅有根或芽器官的分别形）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；成，即无根的芽或无芽的根； （2）先长芽，后长根，）先长芽，后长根，多数情况多数情况； （3）先长根，再从根的基部长芽。这种）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；叶植物； （4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。株植株。第三节愈伤组织的形态发生第三节愈伤组织的形态发生愈伤组织愈伤组织芽分化芽分化再生苗再生苗第三节第三节 愈伤组织的形态发

15、生愈伤组织的形态发生小麦的形态发生小麦的形态发生试管苗试管苗胚状体（胚状体（embryoid）：）：指在组指在组织培养中，由一个非合子细胞织培养中，由一个非合子细胞( (体细胞体细胞) )，经胚胎发生和胚胎，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚心形胚、鱼雷胚和子叶胚5 5个个时期），形成具有双极性的胚时期），形成具有双极性的胚状结构。状结构。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生二、胚状体方式（二、胚状体方式（somatic embryo）注意：体细胞注意：体细胞胚胚1、不同于合子胚不同于合子胚2、不同于孤雌不同于孤雌/雄胚

16、雄胚3、不同于器官发生方式形成的幼苗不同于器官发生方式形成的幼苗第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体与合子胚的比胚状体与合子胚的比较较:第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生由外植体经胚状体形成完整植株的过程：由外植体经胚状体形成完整植株的过程：外植体外植体脱脱分分化化愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体再生植株再生植株第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别: 胚状体胚状体具有两极性具有两极性，即有茎端和根端。，即有茎端和根端。 胚状体的胚状体的维管组织与外植体的维管组维管组

17、织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系织无解剖结构上的联系。 胚状体胚状体维管组织的分布是独立的维管组织的分布是独立的“Y”“Y”字形字形。第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生体细胞胚发生与器官发生体细胞胚发生与器官发生第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生胚状体方式比不定芽方式有更多的优点：胚状体方式比不定芽方式有更多的优点： 胚状体产生的数量比不定芽多；胚状体产生的数量比不定芽多； 胚状体可以制成人工种子，便于运输和胚状体可以制成人工种子，便于运输和保保存存； 胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。第三节第三节 愈伤组织的形态

18、发生愈伤组织的形态发生第四节第四节 愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用1 1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；度；2 2、培育无病毒苗木；、培育无病毒苗木；3 3、获得倍性不同的植株；、获得倍性不同的植株；4 4、克服远缘杂交困难；、克服远缘杂交困难；5 5、利于种质资源长期保存和远距离运输；、利于种质资源长期保存和远距离运输；6 6、提供育种中间材料；、提供育种中间材料；7 7、诱发和离体筛选突变体；、诱发和离体筛选突变体；8 8、制造人工种子。、制造人工种子。第四节第四节 愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用本章小结：1、愈伤组织培养含义、愈伤组织培养含义2、愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期。、愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期。3、诱导期、分裂期、分