第一章激光扫描共聚焦显微镜基本结构、特点

1、第二部分 激光生物技术 目前，较成熟的激光生物技术有： 1.激光显微镜：激光共聚焦断层扫描显微镜、激光多普勒显微术； 2.激光光谱分析技术：激光微束技术、激光流式细胞仪分析技术等。 3.激光超短脉冲技术：激光DNA测序技术激光扫描共聚焦显微镜技术及其应用 光学显微镜17世纪 Hook观察到细胞形态 电子显微镜1931年电镜诞生 细胞超微结构 共聚焦显微镜55年Minsky建立了一台工作显微镜，57年提出共聚焦理论，并获得了美国专利 60年激光诞生1590年荷兰詹森发明第一台显微镜 69年耶鲁大学Davidovits和Egger等，物镜扫描式共聚焦 70年牛津大学Sheppard和Wilson等

2、，台阶式扫描共聚焦 1987年，White 和Amos 在Nature发表了“共聚焦显微镜时代的到来”论文。 近二十年来，人们对共焦高分辨率，采集图像快 速技术的改进及应用开发不断进行，出现了很多 新的技术，如双光子、FCS、FLIM、STED等。PtK2 细胞：微管，细胞核拟南芥细胞：叶绿体 细胞核双染 激光扫描共聚焦显微技术 (confocal)是目前生物医学等领域最先进的荧光成像和细胞分析手段之一。近年来，该技术发展迅速、应用领域日趋广泛。第一章 激光扫描共聚焦显微镜 的基本结构、特点及工作原理1.基本结构laser confocal scanning microscope, LCSM独

3、特恒温培养箱 专用CO2培养室（精确控制CO2浓度、温度、湿度等）； 专用加药及显微注射的小孔（方便加药注射）。实际上是一台特殊的荧光显微镜： 共扼聚焦装置扫描装置激光光源检测及图像分析系统荧光显微镜（装有微距步进马达）普通荧光显微镜成像效果不足： 样品所有点被同时照射和参与成像; 图像发虚和分辨率降低其一，其二是 Non-Confocal Scan of the 3D Reconstruction of Astrocyte by Same Cell Simulated Fluorescence Process 共聚焦系统 CCD CONFOCAL 当观察样品稍厚时，普通荧光显微镜接收来自焦平

4、面及其上、下方的散射荧光，来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低 。 焦平面以外的荧光结构模糊、发虚与普通荧光显微镜比较，CONFOCAL的特点：的特点： 1.光学结构为共扼聚焦结构，抑制图像的模糊，获得清晰的图像； 2.增加了激光扫描部分，可连续、固定范围内小功率扫描，记录动态变化； 3.具有更高的纵向分辨率，可实现样品的多层扫描（细胞CT）。Fluorescent MicroscopeArc LampEmission FilterExcitation DiaphragmOcularExcitation FilterObjectiveLaserPinholeExcitatio

5、n PinholePMTExcitation FilterConfocal MicroscopeCONFOCAL的特点的特点C-CCD cameraConfocal细胞标本2.主要功能特点1) 可无损伤地对样品进行逐层断层扫描，并将各层面的连续光切片进行三维立体重构，实现对样品三维立体结构的观察、空间定位、定量测定（面积、厚度、空间距离、体积等）；2） 能够对活体的各种生理信号（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、膜电位、pH值等）的动态变化及离子分布作毫秒级的动态观察和监测；3） 利用激光的点光源高能量特点可进行细胞生物学实验，如膜流动性、细胞间通讯、细胞损伤和损毁实验等。3. 基本原理激光共

6、聚焦扫描显微镜光路图激光器样品分光镜针孔检测器物镜针孔激光器样品分光镜针孔检测器针孔物镜激光器样品分光镜针孔检测器物镜Confocal原理: 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。 照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。 抑制同一焦平面上非测量点的杂散光； 抑制焦平面外的光。 计算机将被探测点显示在计算机屏幕上； 扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦

7、图像。 焦平面上的一层二维光切片 载物台沿Z 轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上 随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的二维光切图像 。 利用软件叠合，即可获得重构的三维立体图像。小结* LSCM的光源为激光，单色性好，基本消色差，其横向分辨率比普通光镜高，成象聚焦后焦深小，因此也具有较高纵向分辨率。* 可无损伤地对样品作不同深度的层扫描和荧光强度测量，不同焦平面的光学切片经三 维重建后能得到样品的三维立体结构 形象的称为显微“CT”。 * 物点在物镜的焦点上，像点在会聚透镜的焦点上，所以称为共聚焦。 抑制同一焦平面上非测量点的杂散光； 抑制焦

8、平面外的杂散光。观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）LSCM的基本设计特点照明成像方式： 点照明、照明 pinhole 和探测pinhole 共轭(共聚焦), 被探测点所在的平面为共焦平面, 点光源以逐点、逐行、逐面快速扫描成像。 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析 具有多个（四个）荧光通道，可同时对多重染色样品进行观察4.主要配制及性能指标1) 激光光源： 配有Ar/ArKr激光器、GreNe激光器、HeNe激光器。 激发波长为: 458nm、476nm、488nm、514nm、543nm、568nm 和633nm Ar激光器: 458nm, 476nm

9、, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm2) 物镜： （540）物镜、100油镜； 高倍（40以上）物镜的分辨率为0.3m，物镜放大倍数精确度达5%以内。3) 总放大倍数： （51000）范围 另电子放大倍数132倍4) 激光分辨率：250nm5) 功能：明视场、DIC（微分干涉） 6) 样品最大厚度: 取决于物镜的NA、物镜的工作距离、激光的穿透力(单光子- 50 m ；双光子-500 m ) 、样品的透明度，Z轴的最大移动范围(166m、Z-wide)。 待测样品最大厚度约1-2mm。7) 样品最小光切厚度： Z轴

10、的最小移动步距40nm， Z轴的分辨率为0.35 m8) 四个荧光通道, 一个透射光通道(非共焦图像) 注：对未标记的标本，可采集反射光图像。9) 扫描速度: slow（220lines/s） slow2（440lines/s双向扫描） medium（450lines/s） medium2（900lines/s） fast（1000lines/s） fast2（2000lines/s）10) 扫描密度: 6464、 128128、 512512、 10241024、 20482048Zoom2Zoom4激光扫描共焦显微镜的研究焦点： 荧光染料的开发、细胞的制备方法和电子信号处理能力的提高。 此外，显微镜研发： 1.连续光谱型 Confocal 2.多光子激光扫描显微镜 (Multiphot