WesternBlotting的原理方法及常见问题分析汇编

1、 南方医科大学中医药学院分子生物学实验室 一、一、 概述概述 通过特异性抗体对通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的或组织中的表达情况的信息。信息。 1.1.组织或细胞样品蛋白的提取试剂组织或细胞样品蛋白的提取试剂2.2.蛋白定量试剂蛋白定量试剂 3.3.丙烯酰胺凝胶配置试剂丙烯酰胺凝胶配置试剂4.4.转膜缓冲液试剂转膜缓冲液试剂5.5.固相载体（固相载体（PVDFNCPVDFNC尼龙膜）尼龙膜）6

2、.6.封闭液、洗脱液、抗体稀释液封闭液、洗脱液、抗体稀释液7.7.一抗、二抗一抗、二抗8.8.化学显影液化学显影液 二、二、 2.7 一抗二抗的选择一抗二抗的选择 2.7.1 一抗的选择一抗的选择 2.7.2 二抗的选择二抗的选择 二、二、 3.13.1组织或细胞样品蛋白的提取组织或细胞样品蛋白的提取 a a 蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、蛋白种类分类：胞浆蛋白、膜蛋白、 核蛋白、磷酸化蛋白核蛋白、磷酸化蛋白 线粒体蛋白等。线粒体蛋白等。 b b 样品来源分类：单层贴壁细胞、样品来源分类：单层贴壁细胞、 悬浮细胞悬浮细胞 少量或微量组织样品少量或微量组织样品 大量组织样品大量组织样品 难裂解

3、组织样品难裂解组织样品 一般组织样品一般组织样品 三、三、 3.2蛋白定量蛋白定量 考马斯亮兰法考马斯亮兰法 BCA法法 Lowry法法 BCA蛋白定量法操作：蛋白定量法操作： 三、三、 孔号孔号012345678蛋白标准溶液（L） 0124812162020去离子水（L）20191816128400对应蛋白含量（g） 00.51.02.04.06.08.010.？A+B（50：1）200200200200200200200200200振荡30s，37 30分钟，A562nm测定。以蛋白含量（g）为横坐标， 吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；计算出蛋白含量。 3.33.3凝胶浓度的选择及配置凝胶浓

4、度的选择及配置蛋白分子量蛋白分子量 (kDa) 凝胶浓度凝胶浓度 (%)4-402012-451510-7012.515-1001025-2008三、三、 3.43.4蛋白蛋白Marker Marker 的作用的作用 预染或非预染各种分子量的预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪，有利找准自己的大小和示踪，有利找准自己的目的蛋白。目的蛋白。12%10%8%5%总体积10ml10ml10ml2ml超纯水3.344.61.430%丙烯酰胺43.32.70.331.5M Tirs2.52.52.50.2510%APS0.10.10.10.0210%SD

5、S0.10.10.10.02TEMED0.0040.0040.0060.0036 3.63.6蛋白样品变性（时间、温度）蛋白样品变性（时间、温度）3.63.6蛋白样品上样（顺序、体积）蛋白样品上样（顺序、体积）3.73.7电泳电泳 三、三、 ？三、三、 3.8 3.8 切胶、泡胶、叠胶切胶、泡胶、叠胶 滤纸2张滤纸1张PVDF膜1张滤纸3张 凝胶1块阳极阳极阴极胶、滤纸、膜浸泡位置胶、滤纸、膜浸泡位置3.9 转膜转膜 时滤纸、胶、膜的叠加顺序时滤纸、胶、膜的叠加顺序 三、三、 半干转膜的条件：半干转膜的条件： 分子量大小分子量大小 电流电流=Sx3Sx3叠加示意图叠加示意图正极负极 3.10 3.10封闭封闭 3.11 3.11洗脱洗脱 3.12 3.12加一抗加一抗 （抗体名称、来源、浓度、时间）（抗体名称、来源、浓度、时间）孵育孵育 三、三、 3.13 3.13 洗脱洗脱 3.14 3.14 加二抗加二抗（抗体名称、来源、浓度、时间）（抗体名称、来源、浓度、时间） 3.15 3.15 孵育、洗脱孵育、洗脱 3.16 3.16 加加ECLECL发光液发光液三、三、