分子生物学实验：实验一 实验准备与试剂配置

1、分子生物学实验2015年3月2课程介绍实验课名称：分子生物学实验 36学时 2学分参考教材：分子生物学实验指导魏群 主编，高等教育出版社参考资料：分子克隆 实验指南【美】J.萨姆布鲁克 E.F.弗里奇 T.曼尼阿蒂斯 著 科学出版社精编分子生物学实验指南F.奥斯伯等 科学出版社成绩评定：平时成绩+操作考试成绩 +笔试成绩2015年3月32015年3月4实验一 实验准备与试剂配置2015年3月5具体的实验准备工作清洗玻璃器皿等并烘干烧杯量筒试剂瓶锥形瓶10mL移液管玻璃涂棒培养皿玻璃棒容量瓶整理和打扫实验室清洗烘干包扎、灭菌烘干备用洁净保存2015年3月6具体的实验准备工作包扎需要灭菌的器具和耗

2、材1.5mL小离心管、100mL离心管、吸头、10mL移液管、玻璃涂棒、培养皿使用TOMY全自动灭菌锅，121高温湿热灭菌20min1.5mL小离心管、100mL离心管、吸头、10mL移液管、玻璃涂棒、培养皿取出灭菌完毕的物品置烘箱中烘干备用制作与锥形瓶配套使用的棉塞制备酒精棉球（75%酒精）2015年3月7TOMY全自动灭菌锅的使用（1）检查排放蒸汽的水壶，腔体内的水位与托板齐平。（2）SET键设置温度和时间（121，20min）（3）关闭排气阀，Start机器开始运行，Check Heat检查设置的温度，Stop键终止机器运行。（4）程序运行结束，旋开排气阀或机器自行排气至压力为0。温度降

3、至80以下压力为0时方可开盖。运行过程中勿接触盖子。（5）腔体内经常清洁。2015年3月8LB液体/固体培养基的配制及质粒提取试剂的配制2015年3月9实验目的通过本实验，掌握常用LB液体/固体培养基和质粒提取试剂的配制方法和技术，为接下来的实验作准备。2015年3月10实验仪器电子天平台式天平分析天平磁力搅拌器TOMY SS-325自动蒸汽消毒柜 pH酸度计 2015年3月11磁力搅拌器2015年3月12试剂配制LB液体培养基（1000mL）将胰蛋白胨（bacto-typtone）10g，酵母提取物（bacto-yeast extract）5g，氯化钠10g完全溶解在950mL去离子水中，用

4、NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1000mL，121湿热灭菌20min。冷却后4保存备用。灭菌前，分装LB液体培养基50mL/瓶分装8瓶，剩余的600mL制备固体LB培养基：LB液体培养基分装成200mL/瓶分装3瓶，每瓶加入3g琼脂粉，沸水浴溶解，包扎灭菌。注意2015年3月13试剂配制固体LB培养基：每升LB培养基中加15g琼脂。LB液体培养基200mL/瓶中加琼脂3g，包扎灭菌。灭菌结束后，要趁热将融化的固体LB培养基摇匀，冷却后4保存备用。注意2015年3月14试剂配制溶液(pH8.0)(100mL）50mmol/L葡萄糖25mmol/L TrisHCl(pH8.0)1

5、0mmol/L EDTA(pH8.0)称量溶解调节pH值定容灭菌溶液0.4mol/L NaOH (50mL)2%SDS (50mL)用前等体积混合。注意：两种试剂分开配制。称量溶解定容溶液 (100mL)5mol/L 乙酸钾 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mL2015年3月15试剂配制70%乙醇（200mL,100mL/瓶分装）放置于20冰箱保存，用后即放回。0.5mol/L EDTA(pH8.0)（200mL）50TAE（500mL）121g Tris碱28.55mL 冰乙酸50mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)注意：0.5mol/L EDTA(pH8.0)已经配好。2

6、015年3月16试剂瓶标签示意图试剂名称试剂浓度配制日期个性标签例：周二413晚上2015年3月17试剂配制分工LB液体/固体培养基溶液(100mL)溶液溶液(pH4.8) (100mL)70%乙醇0.5mol/L EDTA(pH8.0)（200mL）50TAE（500mL）2015年3月18高压灭菌LB液体/固体培养基溶液溶液2015年3月19思考题为什么在实验前要做详细的准备工作?TOMY全自动灭菌锅的正确使用步骤是什么?分子实验准备中，为什么要对器具和耗材等进行清洗和高温湿热灭菌?如果不灭菌，可能会对实验产生什么样的影响?结合碱裂解法提取质粒的原理，思考在配制溶液时，为什么要使用pH酸度计调节溶液的pH值？怎样配制LB液体/固体培养基？2015年3月20板书实验目的了解分子生物学实验中使用的仪器、耗材、试剂等准备工学习质粒DNA提取试剂的配制方法。实验原理无菌概念酶（DNA酶、RNA酶）的影响质粒DNA实验步骤耗材：清洗烘干包扎灭菌烘干（备用）试剂：称量溶解定容分装灭菌调pH2015年3月21准备清单直径9cm培养皿（50块/班）100mL蓝盖螺口试剂瓶（