肿瘤血管生成的分子机制常用研究方法

1、会计学1肿瘤血管生成的分子机制常用研究方法肿瘤血管生成的分子机制常用研究方法 肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法主要内容主要内容:第一节第一节 肿瘤血管生成的基本过程肿瘤血管生成的基本过程第二节第二节 肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管形态和生物学特性第三节第三节 肿瘤血管生成的调控机制肿瘤血管生成的调控机制第四节第四节 抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用第五节第五节 肿瘤血管生成常用研究方法肿瘤血管生成常用研究方法 人体肿瘤大部分为实体瘤。实体瘤瘤组织由瘤人体肿瘤大部分为实体瘤。实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成，后者主要包括

2、血管、淋巴管、结细胞和间质构成，后者主要包括血管、淋巴管、结缔组织、炎细胞及细胞外基质等成分。其中血管和缔组织、炎细胞及细胞外基质等成分。其中血管和结缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。结缔组织起营养、支持瘤细胞的作用。 肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成成( (angiogenesis) )和淋巴管生成和淋巴管生成( (1ymphangiogenesis) )实现的，并在肿瘤的生长和扩实现的，并在肿瘤的生长和扩散散( (侵袭和转移侵袭和转移) )中起重要作用。中起重要作用。 第一节第一节 肿瘤血管生成的基本过程肿瘤血管生成的基本过程一、血管生成现象一、

3、血管生成现象 19451945年年AlgireAlgire提出了提出了“肿瘤血管生成肿瘤血管生成( (tumor angiogenesis) )”或或“血管新生化血管新生化( (neovasclarzation) )”概概念。对血管生成重要性的认识，特别是提出念。对血管生成重要性的认识，特别是提出“肿肿瘤生长依赖于血管生成瘤生长依赖于血管生成”观点，始于观点，始于19711971年年Folkman对肿瘤血管生成的研究报道。对肿瘤血管生成的研究报道。二肿瘤血管生成的基本过程二肿瘤血管生成的基本过程( (一一) )血管生成的基本步骤：血管生成的基本步骤：血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡，血

4、管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡，导致内皮细胞激活，产生血管生成表型；导致内皮细胞激活，产生血管生成表型；血管部位细胞外基质改变、基底膜降解血管部位细胞外基质改变、基底膜降解，内皮细胞芽生、增殖和迁移；，内皮细胞芽生、增殖和迁移；新生内皮细胞索形成管新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻及管腔；状毛细血管襻及管腔；新生血管管腔的贯通。新生血管管腔的贯通。( (二二) )肿瘤血管生成的过程肿瘤血管生成的过程1 1肿瘤生长的阶段性肿瘤生长的阶段性 无血管期无血管期(avascular phase)(avascular phase)或称血管前期或称血管前期(prevascular phase) (p

5、revascular phase) 肿瘤直径不超过肿瘤直径不超过1 12mm 2mm 血管期血管期(vascular phase) (vascular phase) 肿瘤迅速生长并发生转移肿瘤迅速生长并发生转移 2.2.肿瘤血管的起源肿瘤血管的起源 肿瘤中的血管可能有肿瘤中的血管可能有3 3种来源：种来源：血管生成血管生成: :以两种方式发生以两种方式发生, ,一是肿瘤细胞团先处于一是肿瘤细胞团先处于无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因子，无血管期生长，后因缺氧而产生大量血管生成因子，从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿主组织从而诱导血管生成；另一种是瘤细胞先依赖宿主组织已存在的血管

6、生长，继而出现瘤内血管消退，然后再已存在的血管生长，继而出现瘤内血管消退，然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成。因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成。 血管套叠性生长血管套叠性生长内皮祖细胞内皮祖细胞(endot helial progenitor cell ,EPC) EPC 为为血管内皮细胞的前体细胞血管内皮细胞的前体细胞,参与胚胎的血管生成参与胚胎的血管生成,也称也称为成血管细胞。为成血管细胞。EPC 主要来源于骨髓主要来源于骨髓, 表达表达CD133 、CD34和和VEGFR2。3 3肿瘤血管生成的过程肿瘤血管生成的过程 瘤细胞和巨噬细胞瘤细胞和巨噬细胞血管生成因子血管生

7、成因子(VEGF) (VEGF) 等等小血小血管或毛细血管伸展管或毛细血管伸展内皮细胞迁移形成毛细血管芽内皮细胞迁移形成毛细血管芽新生毛细血管形成并连通。新生毛细血管形成并连通。 第二节第二节 肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管形态和生物学特性 肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而且肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管，而且在生物学功能上也有其特殊性。在生物学功能上也有其特殊性。一肿瘤微血管形态表现一肿瘤微血管形态表现 肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织，肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织，但分布上并不均一。血管生成最活跃、微血管密度最但分布上并不均一。血管生成最活跃、微

8、血管密度最高的区域被称为所谓高的区域被称为所谓“血管热点区血管热点区”(hot spots)(hot spots)，这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域。很多肿这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域。很多肿瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘。瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘。 肿瘤的新生血管肿瘤的新生血管分布上常常无规律分布上常常无规律，分支紊乱，分支紊乱，管腔不规则，表现为狭窄、扩张或扭曲。新生血管呈管腔不规则，表现为狭窄、扩张或扭曲。新生血管呈血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有一层内皮细胞；血窦状、条索状，管壁薄，甚至仅有一层内皮细胞；或管壁很厚，但或管壁很厚，但结构上仍

9、然不完善结构上仍然不完善。内皮细胞比较幼。内皮细胞比较幼稚，细胞间常有裂隙，且稚，细胞间常有裂隙，且缺乏基底膜缺乏基底膜，有时血管外的，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。 肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的结构基础，也是肿瘤转移途径之一。不同类型肿瘤间结构基础，也是肿瘤转移途径之一。不同类型肿瘤间质血管没有本质区别，但在形态和数量上却有不同。质血管没有本质区别，但在形态和数量上却有不同。 生长活跃的恶性肿瘤常富于血管。如内分泌肿生长活跃的恶性肿瘤常富于血管。如内分泌肿瘤、肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞瘤、

10、胶质瘤、肾癌、骨肉瘤、绒毛膜癌、破骨细胞瘤、胶质母细胞瘤和肝细胞癌等。母细胞瘤和肝细胞癌等。 不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶质不同肿瘤血管的形态又有一定的差异，如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮细胞呈不母细胞瘤中新生血管不仅丰富，而且内皮细胞呈不同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、肝细胞癌等血管同程度的增生、肥大；绒毛膜癌、肝细胞癌等血管呈壁薄、明显扩张的血窦。呈壁薄、明显扩张的血窦。 第三节第三节 肿瘤血管生成的调控机制肿瘤血管生成的调控机制一、血管生成因子一、血管生成因子 (一一)VEGF及其受体家族及其受体家族 (二二) 细胞外基质与基质金属蛋白酶细胞外基质与基质金属蛋白酶 (

11、三三) Ets家族成员家族成员 (四四) 纤维母细胞生长因子纤维母细胞生长因子(FGF)家族及其受体家族及其受体 (五五) 血小板源内皮细胞生长因子血小板源内皮细胞生长因子(PD-ECGF) （六）其它血管生成因子（六）其它血管生成因子 肿瘤血管生成受多种血管生成因子肿瘤血管生成受多种血管生成因子( (angiogenic factors)和血管生成抑制物和血管生成抑制物(angiogenesis inhibitors)的调控。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺的调控。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释

12、放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成。组放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成。组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子，对血管织中同时也存在内源性血管生成抑制因子，对血管生成起抑制作生成起抑制作用。用。 一、血管生成因子一、血管生成因子 血管生成的始动需要血管生成因子。一系列血管血管生成的始动需要血管生成因子。一系列血管生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏附分子及其抑生成因子、细胞因子、细胞外基质和黏附分子及其抑制物，以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过制物，以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过程。程。( (一一) )血管内皮生长因子（血管内皮生长因子（VEGFVEGF）及其受体家

13、族）及其受体家族 1 1血管内皮生长因子家族血管内皮生长因子家族 血管内皮生长因子（血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）又称血管通透性）又称血管通透性因子因子( (vascular permeability factor,VPF) )，为分子量，为分子量34-45kD34-45kD的同源二聚体糖蛋白。的同源二聚体糖蛋白。 VEGF VEGF基因通过转录水平的剪切，可产生基因通过转录水平的剪切，可产生5 5种变异体，种变异体，即即VEGF206VEGF206、VEGFl89VEGFl89、VEGFl65VEGFl65、VEGFl45

14、VEGFl45和和VEGFl21VEGFl21，分别由分别由206206、189189、165165、145145和和121121个氨基酸组成。其中个氨基酸组成。其中以以VEGF165VEGF165最具特征性，其次是最具特征性，其次是VEGF121VEGF121二者均为可溶性二者均为可溶性分泌蛋白，扩散力强，易于到达靶细胞。分泌蛋白，扩散力强，易于到达靶细胞。近年又发现其他一些与近年又发现其他一些与VEGFVEGF功能相似、结构上有一定功能相似、结构上有一定同源性的多肽因子，包括胎盘生长因子同源性的多肽因子，包括胎盘生长因子( (placentor growth factor，PIGF) )，

15、VEGF-B(VEGF(VEGF相关因子，相关因子，VEGF-related factor，VRF) )，VEGF-C(VEGF(VEGF相关蛋相关蛋白，白，VEGF-related protein，VRP) )，以及，以及VEGF-DFIGF和和VEGF-E等成员，它们共同构成等成员，它们共同构成VEGFVEGF家族。家族。 VEGF主要由血管周围的细胞产生，并通过旁分泌机主要由血管周围的细胞产生，并通过旁分泌机制作用于内皮细胞，在促进血管形成、抑制内皮细胞制作用于内皮细胞，在促进血管形成、抑制内皮细胞的凋亡及提高血管通透性等方面发挥重要作用。的凋亡及提高血管通透性等方面发挥重要作用。2 2

16、VEGFVEGF受体类型：受体类型：VEGFVEGF只有与其特异性受体结合后才只有与其特异性受体结合后才能发挥生物学功能。目前，已鉴定并克隆出能发挥生物学功能。目前，已鉴定并克隆出3 3种受体，种受体，即即VEGFVEGF受体受体l (VEGFR-1，又称，又称flt-1) )、VEGF受体受体2 2 ( (VEGFR-2，又称，又称flk-1或或KDR) )及及VEGF受体受体3 (VEGFR-3又称又称flt-4), ), 均属酪氨酸激酶受体，称为均属酪氨酸激酶受体，称为FltFlt家族。家族。前两种受体一般只表达于血管内皮细胞表面，前两种受体一般只表达于血管内皮细胞表面，但偶尔在其它类型

17、细胞，如肿瘤细胞中也有表达；但偶尔在其它类型细胞，如肿瘤细胞中也有表达；Flt-4Flt-4在胎儿早期静脉的内皮细胞上呈一过性表达在胎儿早期静脉的内皮细胞上呈一过性表达, ,胎儿后期和出生后的内皮细胞则不再表达；在成人胎儿后期和出生后的内皮细胞则不再表达；在成人Flt-4Flt-4只在淋巴管的内皮细胞上表达。由于只在淋巴管的内皮细胞上表达。由于FltFlt家族家族基因的表达部位不同，其配体的结合部位也不同。基因的表达部位不同，其配体的结合部位也不同。 早期血管的形成需要早期血管的形成需要VEGFVEGF的调节，它们与内皮的调节，它们与内皮细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合，引起内皮细胞细胞上相应的

18、酪氨酸激酶受体结合，引起内皮细胞分裂和分化，并形成管腔样结构。分裂和分化，并形成管腔样结构。 在胚胎发育过程中，在胚胎发育过程中，VEGF(VEGF(主要是主要是VEGF-A)VEGF-A)通过通过其受体其受体VEGFR-1(Flt-1)VEGFR-1(Flt-1)和和VEGFR-2(Flk-1VEGFR-2(Flk-1KDR)KDR)促进促进内皮分化、增殖、迁移和原始血管形成。内皮分化、增殖、迁移和原始血管形成。 由新形成的内皮组装成管腔样结构需要由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR-1VEGFR-1的表达和激活，而的表达和激活，而VEGFR-3VEGFR-3的表达与内皮细胞形成静的

19、表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关。脉或淋巴管有关。 VEGF VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管及其抑制因子；增加血管通透性等特性，在血管生成中发挥重要作用。生成中发挥重要作用。 VEGFVEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达。有过表达。VEGFVEGF及其受体在肿瘤中的表达常与肿及其受体在肿瘤中的表达常与肿瘤分化程度密切相关。大多数实体瘤瘤分化程度密切相关。大多数实体瘤V

20、EGFVEGF基因均基因均有过表达，有过表达，VEGF165 VEGF165 、VEGF121VEGF121两种两种VEGFVEGF最常见。最常见。 在在VEGFVEGF家族中，家族中，VEGF-CVEGF-C和和VEG-DVEG-D既可诱导血管生既可诱导血管生成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道，人体多成，又可诱导淋巴管生成。已有研究报道，人体多种肿瘤细胞高表达种肿瘤细胞高表达VEGF-CVEGF-C。体内转基因实验也证实。体内转基因实验也证实，肿瘤细胞，肿瘤细胞VEGF-CVEGF-C的高表达能选择性地诱导肿瘤组的高表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成。织淋巴管生成。 肿瘤组织中的肿瘤组织

21、中的VEGF-CVEGF-C和和VEGF-DVEGF-D还来源于浸润的巨还来源于浸润的巨噬细胞。噬细胞。 缺氧是许多细胞系产生缺氧是许多细胞系产生VEGF的一个强烈的诱导因的一个强烈的诱导因子。子。 离体条件下，葡萄糖缺乏亦是离体条件下，葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因表达的诱因。VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。在肿瘤坏死灶周边常呈强表达。 肿瘤中诱生型一氧化氮合酶肿瘤中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)(iNOS)表达水平常表达水平常与与VEGFVEGF呈正相关，呈正相关，NONO与与VEGFVEGF之间具有相互调节作用。之间具有相互调节作用。 多种癌基因的激活通过上调多种癌基因的激活通过上

22、调VEGFVEGF表达而诱导血管表达而诱导血管生成，失活的抑癌基因生成，失活的抑癌基因( (如突变型如突变型p53p53基因基因) )也参与了也参与了VEGFVEGF介导的血管生成过程。介导的血管生成过程。 ( (二二) ) 细胞外基质与基质金属蛋白酶细胞外基质与基质金属蛋白酶1.1.细胞外基质：人体各种组织均由细胞外基质细胞外基质：人体各种组织均由细胞外基质( (extra cellular matrix，ECM) )构成支架，根据构成支架，根据其分布部位、组成成分及功能的不同可将其分为其分布部位、组成成分及功能的不同可将其分为基膜基膜(BM)(BM)和间质结缔组织两大类。和间质结缔组织两大

23、类。 ECMECM成分由成分由4 4大家族组成：胶原蛋白、蛋白多大家族组成：胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白、糖、弹性蛋白、ECMECM糖蛋白。糖蛋白。目前发现目前发现ECMECM糖蛋白有糖蛋白有1010余种，如层粘连蛋白、纤维余种，如层粘连蛋白、纤维粘连蛋白粘连蛋白( (fibronectin，FN) )等。其中等。其中FNFN主要分布于皮主要分布于皮肤、肌腱、血管壁和骨基质等组织。肤、肌腱、血管壁和骨基质等组织。 多数多数ECMECM糖蛋白具有粘附功能，这种功能的发挥糖蛋白具有粘附功能，这种功能的发挥与其分子内部含有的某些特殊的蛋白片段有关，通过与其分子内部含有的某些特殊的蛋白片段有关，通过这

24、些片段，这些片段，ECMECM糖蛋白就可以与细胞及糖蛋白就可以与细胞及ECMECM其它成分结其它成分结合，参与细胞的粘附、迁移、生长和分化。合，参与细胞的粘附、迁移、生长和分化。2. 2. 基质金属蛋白酶的家族成员：随着现代基础医基质金属蛋白酶的家族成员：随着现代基础医学科学理论和实验技术的飞速发展，大量的学科学理论和实验技术的飞速发展，大量的MMPsMMPs被被发现、分离、纯化及测序。它们广泛地分布于动植发现、分离、纯化及测序。它们广泛地分布于动植物界，几乎能降解所有生物体内的物界，几乎能降解所有生物体内的ECMECM成分。到目成分。到目前为止，前为止，MMPsMMPs家族至少包含家族至少包

25、含2020种酶，而且其新成员种酶，而且其新成员仍在继续增加。仍在继续增加。3. 3. 基质金属蛋白酶的促新血管形成作用：电镜观察基质金属蛋白酶的促新血管形成作用：电镜观察显示，新的毛细血管围成环状及新合成的细胞外基显示，新的毛细血管围成环状及新合成的细胞外基质成分沉积、铺垫后，血管环前端新合成的质成分沉积、铺垫后，血管环前端新合成的BMBM就开就开始了始了MMPsMMPs所介导的蛋白水解过程，内皮细胞迁移将所介导的蛋白水解过程，内皮细胞迁移将始于局部水解，形成一个新的毛细血管芽，随后又始于局部水解，形成一个新的毛细血管芽，随后又经历了一系列细胞外蛋白水解酶的活化与抑制的动经历了一系列细胞外蛋白

26、水解酶的活化与抑制的动态循环。体外细胞培养发现，当将人脐静脉内皮细态循环。体外细胞培养发现，当将人脐静脉内皮细胞培养于胞培养于BMBM样物质上时，内皮细胞很快排成直线，样物质上时，内皮细胞很快排成直线，围成管状，编织成血管网。围成管状，编织成血管网。4.MMPs4.MMPs在不同癌组织中的表达：人类癌组织种类繁多在不同癌组织中的表达：人类癌组织种类繁多，研究癌细胞所产生的各种，研究癌细胞所产生的各种MMPsMMPs分子的特点及其在各分子的特点及其在各种癌组织中的分布情况，对了解癌的浸润和转移过程种癌组织中的分布情况，对了解癌的浸润和转移过程有重要意义。已有资料表明，不同种类的癌细胞所表有重要意

27、义。已有资料表明，不同种类的癌细胞所表达的达的MMPsMMPs分子种类和表达量也不相同。例如分子种类和表达量也不相同。例如: :乳腺癌乳腺癌:MMP-7，-8及及-13表达量明显高于正常表达量明显高于正常乳腺组织。乳腺组织。5. MMPs5. MMPs激活与癌的浸润和转移：激活与癌的浸润和转移：多数癌组织中潜多数癌组织中潜在型在型MMP-2MMP-2的激活程度是癌发生转移的重要指标。的激活程度是癌发生转移的重要指标。因此检测癌组织内因此检测癌组织内MMP-2MMP-2活化酶活化酶MT-MMPMT-MMP对癌的治疗对癌的治疗具有重要意义。具有重要意义。 ( (三三) Ets) Ets家族成员家族

28、成员 EtsEts原癌基因于原癌基因于19831983年分别在不同的实验室中分离年分别在不同的实验室中分离成功。迄今发现至少有成功。迄今发现至少有Ets-1Ets-1、Ets-2Ets-2等等1111种种EtsEts基因基因家族成员。家族成员。Ets-1与新血管形成：血管周围基膜的与新血管形成：血管周围基膜的分解分解和内皮细和内皮细胞本身的胞本身的迁移力迁移力是血管生成的两个关键因素。前者主是血管生成的两个关键因素。前者主要与要与MMPl有关，后者则主要与有关，后者则主要与Ets-1有关。有关。 已发现的已发现的4 4种典型的血管生长因子种典型的血管生长因子aFGFaFGF、bFGFbFGF、

29、VEGFVEGF及及EGFEGF都能调节人脐静脉内皮细胞都能调节人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(HUVECs)、ECV-304ECV-304细胞以及人网膜微血管内皮细胞中的细胞以及人网膜微血管内皮细胞中的ets-1 mRNAets-1 mRNA的表达。上述培养的细胞当受到生长因的表达。上述培养的细胞当受到生长因子等刺激时，子等刺激时，2 2 小时后其小时后其ets-l mRNAets-l mRNA的表达呈最高的表达呈最高值，值，1212小时后又恢复到原来水平。小时后又恢复到原来水平。 如用如用VEGFVEGF刺激培养的内皮细胞时，其刺激培养的内皮细胞时，其DNA-EtsDNA-Ets复合物复

30、合物明显增多；而用明显增多；而用VEGFVEGF和和GGAA(EtsGGAA(Ets功能域的竞争性抑功能域的竞争性抑制剂，制剂，control competior)control competior)，同时刺激培养的内皮，同时刺激培养的内皮细胞时，细胞时，DNA-EtsDNA-Ets复合物的量则明显减少。复合物的量则明显减少。 血管生长因子作用于内皮细胞时能够引起内皮血管生长因子作用于内皮细胞时能够引起内皮细胞细胞Ets-1 mRNA的表达，而且其作用受转录水平的表达，而且其作用受转录水平的调节。的调节。( (四四) ) 纤维母细胞生长因子纤维母细胞生长因子(FGF)(FGF)家族及其受体家族

31、及其受体 目前研究最为深入的是碱性成纤维细胞生长因子目前研究最为深入的是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(bFGF)和酸性成纤维细胞生长因子和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)(aFGF)，两者在结，两者在结构上是相关的。构上是相关的。 bFGFbFGF是一种广泛存在于人体各组织中的生物活性是一种广泛存在于人体各组织中的生物活性物质，被认为是血管内皮细胞、成纤维细胞、神经细物质，被认为是血管内皮细胞、成纤维细胞、神经细胞等生长的刺激物。胞等生长的刺激物。 bFGF bFGF是体内分布广泛的生长因子之一，如脑是体内分布广泛的生长因子之一，如脑、心、肝、胎盘和白细胞等均有存在。、心、肝、胎盘和白

32、细胞等均有存在。bFGFbFGF除分布除分布于细胞内，还分布于许多细胞的胞膜及胞外基质中于细胞内，还分布于许多细胞的胞膜及胞外基质中。它也可在不同肿瘤中表达，包括膀胱癌、神经胶。它也可在不同肿瘤中表达，包括膀胱癌、神经胶质瘤、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、肾细胞癌和甲状腺质瘤、肝癌、胃肠癌、乳腺癌、肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细胞系都可以合成它。癌等许多培养的细胞系都可以合成它。其功能具有多样性，可促进内皮细胞的有丝分裂其功能具有多样性，可促进内皮细胞的有丝分裂、趋化性和迁移，刺激内皮细胞产生胶原酶降解、趋化性和迁移，刺激内皮细胞产生胶原酶降解基底膜，诱导来源于中胚层和神经外胚层细胞的基底膜，诱导来

33、源于中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化。增殖和分化。bFGFbFGF也表现出亲神经性行为，促进也表现出亲神经性行为，促进神经元的存活和分化。神经元的存活和分化。 bFGFbFGF和和aFGFaFGF均与肝素有很强的亲和力，研究表均与肝素有很强的亲和力，研究表明这种高亲和力对于明这种高亲和力对于FGFFGF与细胞表达的受体结合是与细胞表达的受体结合是非常重要的。非常重要的。 bFGF bFGF的生物学作用是通过与其特异性的细胞表的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受体面受体FGFFGF受体受体(FGFreceptors(FGFreceptors，FGFR)FGFR)结合而介导实结合而介导实现的

34、。已经识别现的。已经识别4 4种种FGFRFGFR，包括，包括FGFR-1(flg)FGFR-1(flg)、FGFR-FGFR-2(bek)2(bek)、FGFR-3FGFR-3和和FGFR-4FGFR-4。FGFR-1FGFR-1在在bFGFbFGFFGFRFGFR系系统中的作用最大。统中的作用最大。正常脑神经元和胶质细胞中正常脑神经元和胶质细胞中FGFR-FGFR-1 1的表达呈现明显的异质性，即组织中有些细胞呈现的表达呈现明显的异质性，即组织中有些细胞呈现FGFR-1FGFR-1阳性，有些则显示阴性；血管内皮细胞亦是阳性，有些则显示阴性；血管内皮细胞亦是如此。如此。 ( (五五) ) 血

35、小板源内皮细胞生长因子血小板源内皮细胞生长因子(PDGF)(PDGF) 血小板源性生长因子血小板源性生长因子( (platelet-derived growth factor，PDGF) )是由多种细胞产生的肽类生长因子是由多种细胞产生的肽类生长因子。由于其在组织修复、胚胎发育、免疫及多种常见。由于其在组织修复、胚胎发育、免疫及多种常见疾病的愈复中起着重要作用。疾病的愈复中起着重要作用。 除血小板外，单核巨噬细胞系统的细胞、血管除血小板外，单核巨噬细胞系统的细胞、血管内皮细胞、胎盘和胚胎细胞、系膜细胞及某些肿瘤内皮细胞、胎盘和胚胎细胞、系膜细胞及某些肿瘤细胞均可产生和释放细胞均可产生和释放PD

36、GFPDGF。纤维母细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及神经细胞纤维母细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及神经细胞等多种细胞均存在等多种细胞均存在PDGFPDGF受体。受体。PDGFPDGF与细胞膜上的与细胞膜上的专一受体结合后可诱发一系列细胞内反应而发挥专一受体结合后可诱发一系列细胞内反应而发挥生物学效应，主要表现在生物学效应，主要表现在3 3方面：促进细胞的方面：促进细胞的有丝分裂：有丝分裂：PDGFPDGF能刺激多种细胞如血管内皮细胞能刺激多种细胞如血管内皮细胞、纤维母细胞和胶质细胞等的分裂、增殖；、纤维母细胞和胶质细胞等的分裂、增殖；趋化性：趋化性：PDGFPDGF对纤维母细胞、平滑肌细胞和嗜中对纤维

37、母细胞、平滑肌细胞和嗜中性粒细胞有趋化性，性粒细胞有趋化性，受体介导趋化反应，而受体介导趋化反应，而受受体则抑制趋化反应；血管收缩效应：体则抑制趋化反应；血管收缩效应：PDGFPDGF收缩大收缩大鼠主动脉的作用较经典的血管紧张素鼠主动脉的作用较经典的血管紧张素IIII更强烈。此更强烈。此外，外，PDGFPDGF通过影响骨骼肌中细胞骨架与细胞膜的相通过影响骨骼肌中细胞骨架与细胞膜的相互作用而致细胞骨架重排，还参与胚胎的发育和生互作用而致细胞骨架重排，还参与胚胎的发育和生长以及中枢神经系统发育过程。长以及中枢神经系统发育过程。（六）其它血管生成因子（六）其它血管生成因子舒血管素舒血管素 ( (An

38、giotropin) )、血管新生素（、血管新生素（Angiogenin）表皮生长因子、转化生长因子等也能刺激内皮细）表皮生长因子、转化生长因子等也能刺激内皮细胞生长。胞生长。 此外，缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的此外，缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的重要刺激因素。缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧重要刺激因素。缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧诱导因子诱导因子-1-1、-2(hypoxia inducing factor-l-2(hypoxia inducing factor-l，-2-2，HIF-1HIF-1HIF-2)HIF-2)和和NF-NF-B,B,其中以其中以HIF-lHIF-l在血

39、管生成在血管生成中的作用最为重要。中的作用最为重要。 特异性作用因子特异性作用因子VEGFVEGF家族、血管生成素家族、血管生成素非特异性作用因子非特异性作用因子FGFFGF家族、家族、HGFHGF、PDGFPDGF、EGFEGF、IL-8IL-8、TNFTNF、TGFTGF、HIF-1HIF-1、癌基因癌基因基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶MMP-2MMP-2、MMP-9MMP-9、MMP-14MMP-14二二. . 血管生成抑制因子血管生成抑制因子 体内存在内源性的血管生成抑制因子，它们通过体内存在内源性的血管生成抑制因子，它们通过影响血管生成过程的各个环节发挥抗血管生成的活性影响血管生成过程

40、的各个环节发挥抗血管生成的活性。血管生成抑制因子大致可分为。血管生成抑制因子大致可分为7 7类：大分子蛋白前类：大分子蛋白前体酶解片段、细胞因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、含体酶解片段、细胞因子、丝氨酸蛋白酶抑制剂、含TSP ITSP I型重复模序的血管生成抑制因子、组织金属蛋型重复模序的血管生成抑制因子、组织金属蛋白酶抑制剂、抑癌基因及其它血管生成抑制因子。白酶抑制剂、抑癌基因及其它血管生成抑制因子。（一）大分子蛋白前体酶解片段（一）大分子蛋白前体酶解片段这些大分子蛋白前体分别来源于血浆这些大分子蛋白前体分别来源于血浆( (如纤溶酶原、如纤溶酶原、抗凝血酶抗凝血酶) )和胞外基质和胞外基质( (如

41、胶原蛋白、基底膜蛋白多如胶原蛋白、基底膜蛋白多糖、纤连蛋白糖、纤连蛋白) )。1.1.纤溶酶原酶解片段纤溶酶原酶解片段血管生成抑制素血管生成抑制素 血管生成抑制素血管生成抑制素(angiostatin)(angiostatin)是最先发现的内是最先发现的内源性血管生成抑制因子之一，它是纤溶酶原的蛋白源性血管生成抑制因子之一，它是纤溶酶原的蛋白酶解产物，最初在酶解产物，最初在LewisLewis肺癌小鼠的血清和尿液中分肺癌小鼠的血清和尿液中分离得到。离得到。 血管生成抑制素特异作用于内皮细胞，它可血管生成抑制素特异作用于内皮细胞，它可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并诱导内皮细胞以抑制内皮细胞的增殖

42、和迁移，并诱导内皮细胞凋亡，它通过与细胞表面的受体结合发挥作用。凋亡，它通过与细胞表面的受体结合发挥作用。 已发现的血管生成抑制素受体：已发现的血管生成抑制素受体：ATPATP合成酶的合成酶的/、angiomotionangiomotion和整体联蛋白和整体联蛋白5353。2. 2. 抗血管生成性抗凝血酶抗血管生成性抗凝血酶(antiangiogenic antithrombin ，aaAT) ) 研究表明研究表明aaATaaAT是切除了羧基端环的抗凝血酶是切除了羧基端环的抗凝血酶。aaATaaAT可特异性地抑制内皮细胞的增殖，而不作可特异性地抑制内皮细胞的增殖，而不作用于其它正常细胞或肿瘤细

43、胞。用于其它正常细胞或肿瘤细胞。aaATaaAT对血管生成对血管生成的抑制作用有剂量依赖性。的抑制作用有剂量依赖性。3. 3. 内皮细胞抑制素内皮细胞抑制素(endostatin)(endostatin) 它可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并诱导内皮它可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并诱导内皮细胞凋亡。细胞凋亡。 内皮细胞抑制素主要的抗血管生成活性是通过抑内皮细胞抑制素主要的抗血管生成活性是通过抑制内皮细胞迁移实现的：它可与内皮细胞表面的制内皮细胞迁移实现的：它可与内皮细胞表面的5151整联蛋白结合，抑制整联蛋白结合，抑制FAKFAK的激活的激活, ,进一步影响其进一步影响其下游下游ERKlERK

44、lp38 MAPKp38 MAPK的活化，从而抑制细胞的迁移、的活化，从而抑制细胞的迁移、影响细胞的存活。影响细胞的存活。 内皮细胞抑制素还可以诱导内皮细胞凋亡。内皮细胞抑制素还可以诱导内皮细胞凋亡。( (二二) )细胞因子细胞因子 IFN-IFN-、IFN-IFN-、IFN-IFN-和和IL-12IL-12、IL-18IL-18是具有是具有多种功能的调节性细胞因子，对肿瘤有直接的抑制多种功能的调节性细胞因子，对肿瘤有直接的抑制作用。近年来的研究发现它们也可以通过间接的作作用。近年来的研究发现它们也可以通过间接的作用方式抑制血管的生成，来达到抗肿瘤的目的。用方式抑制血管的生成，来达到抗肿瘤的目

45、的。它们可以通过下调它们可以通过下调VEGFVEGF和和FGFFGF等生长因子的表达水等生长因子的表达水平来发挥抑制血管生成的活性。白细胞介素平来发挥抑制血管生成的活性。白细胞介素- -12(IL-12)12(IL-12)则是通过提高则是通过提高IFN-IFN-的表达水平，引致的表达水平，引致IP-10IP-10水平增高来发挥其抗血管生成的功能。水平增高来发挥其抗血管生成的功能。（三）丝氨酸蛋白酶抑制剂（三）丝氨酸蛋白酶抑制剂( (Serine protease inhibitor，Serpin) ) 丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族是由一系列具同源丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族是由一系列具同源性的蛋白质组

46、成的蛋白质家族。某些性的蛋白质组成的蛋白质家族。某些SerpinSerpin家族成家族成员有抑制血管生成的活性，这些成员包括员有抑制血管生成的活性，这些成员包括PEDF(pigment epithelium-derived factor)、maspin、血管、血管紧张素原等。紧张素原等。 PEDF PEDF是眼内最重要的血管生成抑制因子。它抑是眼内最重要的血管生成抑制因子。它抑制血管生成的作用主要是通过诱导内皮细胞凋亡实制血管生成的作用主要是通过诱导内皮细胞凋亡实现的，它特异性作用于激活的内皮细胞，而不会影现的，它特异性作用于激活的内皮细胞，而不会影响静止的内皮细胞。响静止的内皮细胞。（四）组

47、织金属蛋白酶抑制剂（四）组织金属蛋白酶抑制剂( (tissue inhibitor of MMP，TIMP) ) TIMP TIMP是体内天然存在的金属蛋白酶抑制物，是体内天然存在的金属蛋白酶抑制物，包括包括TIMP-1TIMP-1、TIMP-2TIMP-2、TIMP-3TIMP-3、TIMP-4TIMP-4。TIMPTIMP在在两个阶段对两个阶段对MMPMMP的活性进行抑制。一是在的活性进行抑制。一是在MMPMMP酶原酶原活化阶段，活化阶段，TIMPTIMP与与MMPMMP形成稳定的复合物，抑制其形成稳定的复合物，抑制其自我活化；二是在自我活化；二是在MMPMMP活化之后，与其按照活化之后，

48、与其按照1 1：1 1的的比例结合，对其活性进行抑制。比例结合，对其活性进行抑制。（五）抑癌基因（五）抑癌基因( (Tumor suppressor gene) )1.p531.p53 p53 p53突变是肿瘤中最常见的基因突变。突变是肿瘤中最常见的基因突变。p53p53基因编基因编码的产物码的产物P53P53蛋白是一种转录因子，它通过调节下游蛋白是一种转录因子，它通过调节下游靶基因的转录，表现出多种生物学功能，其中之一靶基因的转录，表现出多种生物学功能，其中之一是抑制血管生成。是抑制血管生成。P53P53的靶基因中包括多种调节细胞的靶基因中包括多种调节细胞周期和细胞凋亡的基因，它通过激活这些

49、基因的转周期和细胞凋亡的基因，它通过激活这些基因的转录，导致内皮细胞生长周期停滞并促进内皮细胞的录，导致内皮细胞生长周期停滞并促进内皮细胞的凋亡。凋亡。P53P53还通过影响血管生成调节因子还通过影响血管生成调节因子VEGFVEGF的水平的水平抑制血管生成。抑制血管生成。2.VHL2.VHL VHL VHL综合征综合征( (von Hippel-Lindau disease) )是一种以是一种以多个器官发生肿瘤为特征的遗传性疾病，它的致病原多个器官发生肿瘤为特征的遗传性疾病，它的致病原因是因是VHLVHL抑癌基因的种系突变。与抑癌基因的种系突变。与VHLVHL综合征相关的肿综合征相关的肿瘤，如

50、视网膜血管瘤、小脑血管瘤、脊柱血管瘤等都瘤，如视网膜血管瘤、小脑血管瘤、脊柱血管瘤等都是高度血管化的肿瘤。靶向阻断小鼠肝脏的是高度血管化的肿瘤。靶向阻断小鼠肝脏的VHLVHL基因，基因，会导致小鼠肝实质血管化程度加强。这些现象提示我会导致小鼠肝实质血管化程度加强。这些现象提示我们，们，VHLVHL可能有抑制血管生成的作用。可能有抑制血管生成的作用。第四节第四节 抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用 血管生成是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关血管生成是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎、动脉粥样硬化、慢性炎症等血管增生性疾病的节炎、动脉粥样硬化、慢性炎症等血管增生性

51、疾病的重要病理特征，抑制血管的生成对这些疾病的治疗有重要病理特征，抑制血管的生成对这些疾病的治疗有重要的意义。重要的意义。 此后，在某些因素此后，在某些因素( (缺氧、癌基因缺氧、癌基因) )的诱导下，血管生的诱导下，血管生成因子处于上调状态，并且成因子处于上调状态，并且( (或者或者) )血管生成抑制因子血管生成抑制因子处于下调状态，打破了两者之间的动态平衡，使得血处于下调状态，打破了两者之间的动态平衡，使得血管生成机制处于开启状态，开始血管生成的过程。新管生成机制处于开启状态，开始血管生成的过程。新生血管为肿瘤的继续增殖提供了充足的氧气和营养物生血管为肿瘤的继续增殖提供了充足的氧气和营养物

52、质，使肿瘤得以快速生长。质，使肿瘤得以快速生长。 绝大多数实体瘤和血液系统肿瘤的生长都需要绝大多数实体瘤和血液系统肿瘤的生长都需要有血管的生成。原发瘤的血管生成过程也为肿瘤细有血管的生成。原发瘤的血管生成过程也为肿瘤细胞进人血液循环，转移到其它器官提供了机会，因胞进人血液循环，转移到其它器官提供了机会，因此血管生成不仅是肿瘤生长的前提条件，也是促进此血管生成不仅是肿瘤生长的前提条件，也是促进肿瘤转移的重要因素。肿瘤转移的重要因素。 与传统的以肿瘤细胞为靶点的治疗方法与传统的以肿瘤细胞为靶点的治疗方法( (放疗放疗、化疗、化疗) )相比，血管生成抑制剂以肿瘤血管内皮细相比，血管生成抑制剂以肿瘤血

53、管内皮细胞为靶点，具有低毒、广谱及不易产生抗药性的优胞为靶点，具有低毒、广谱及不易产生抗药性的优点。点。一、血管生成抑制剂在肿瘤治疗中的应用一、血管生成抑制剂在肿瘤治疗中的应用 近年来以血管为靶点治疗肿瘤成为肿瘤研究的热近年来以血管为靶点治疗肿瘤成为肿瘤研究的热点之一，血管生成过程的各个环节都可能成为抗血管点之一，血管生成过程的各个环节都可能成为抗血管生成的潜在靶点。肿瘤的血管生成受到多种血管生成生成的潜在靶点。肿瘤的血管生成受到多种血管生成因子的调控，因子的调控，VEGFVEGF是其中作用最强、专属性最高的血是其中作用最强、专属性最高的血管生成因子，这使它成为抗血管生成药物研究的热点管生成因

54、子，这使它成为抗血管生成药物研究的热点之一。目前有多种针对之一。目前有多种针对VEGFVEGF、VEGFRVEGFR及其信号转导途及其信号转导途径的药物在研究之中，此外还开发了多种针对其它生径的药物在研究之中，此外还开发了多种针对其它生长因子及长因子及MMPMMP的小分子药物，其中某些已进入临床试的小分子药物，其中某些已进入临床试验阶段。验阶段。二、内源性血管生成抑制因子在肿瘤治疗中的应用二、内源性血管生成抑制因子在肿瘤治疗中的应用目前已进入临床试验阶段的内源性血管生成抑制因目前已进入临床试验阶段的内源性血管生成抑制因子包括血管生成抑制素、内皮细胞抑制素等。子包括血管生成抑制素、内皮细胞抑制素

55、等。 以内皮细胞抑制素为例以内皮细胞抑制素为例: :在以在以LewisLewis肺癌小鼠为肺癌小鼠为模型的体内抑癌实验中，内皮细胞抑制素使肿瘤完模型的体内抑癌实验中，内皮细胞抑制素使肿瘤完全消退的剂量是全消退的剂量是20mg20mgkgkgd d，而血管生成抑制素，而血管生成抑制素的用量则高达的用量则高达100mg100mgkgkgd d。内皮细胞抑制素的高内皮细胞抑制素的高效抑瘤活性使它成为第一个进入临床试验的此类血效抑瘤活性使它成为第一个进入临床试验的此类血管生成抑制因子。管生成抑制因子。 采用注射重组血管生成抑制因子的方式治疗肿采用注射重组血管生成抑制因子的方式治疗肿瘤存在某些局限性瘤存

56、在某些局限性( (需长期用药、重复注射、用量高需长期用药、重复注射、用量高、成本高、蛋白不易获得、成本高、蛋白不易获得) )，所以采用血管生成抑制，所以采用血管生成抑制因子进行基因治疗的方式越来越受到重视。采用基因子进行基因治疗的方式越来越受到重视。采用基因疗法治疗肿瘤，基因可在体内长期表达、不需在因疗法治疗肿瘤，基因可在体内长期表达、不需在短期内频繁注射、药物用量少、成本低，较蛋白疗短期内频繁注射、药物用量少、成本低，较蛋白疗法有更大的应用潜力。法有更大的应用潜力。 有人将带有内皮细胞抑制素基因的质粒载有人将带有内皮细胞抑制素基因的质粒载体对小鼠进行肌肉注射，观察到血清内皮体对小鼠进行肌肉注

57、射，观察到血清内皮细胞抑制素水平升高，小鼠脑转移肿瘤生细胞抑制素水平升高，小鼠脑转移肿瘤生长显著减慢。长显著减慢。三、抗血管生成疗法的发展趋向三、抗血管生成疗法的发展趋向 虽然已经有数种血管生成抑制剂进入了临床试虽然已经有数种血管生成抑制剂进入了临床试验阶段，但它们在人体实验中所显示的抑瘤效果并验阶段，但它们在人体实验中所显示的抑瘤效果并不如动物实验所显示的结果理想，这说明体内特别不如动物实验所显示的结果理想，这说明体内特别是肿瘤的血管生成过程是一个有多种因素参与、多是肿瘤的血管生成过程是一个有多种因素参与、多条信号通路调控的极其复杂的过程，单独使用某种条信号通路调控的极其复杂的过程，单独使用

58、某种血管生成抑制因子或是阻断与血管生成相关的某条血管生成抑制因子或是阻断与血管生成相关的某条信号通路并不能完全阻断血管的生成。信号通路并不能完全阻断血管的生成。 如果可以尝试将几种作用机制不同的血管生成抑如果可以尝试将几种作用机制不同的血管生成抑制因子制因子( (如血管生成抑制素与内皮细胞抑制素如血管生成抑制素与内皮细胞抑制素) )联合联合应用，应该会取得较单独使用一种因子更好的效果应用，应该会取得较单独使用一种因子更好的效果。此外，抑制肿瘤的血管生成，可以增强肿瘤细胞。此外，抑制肿瘤的血管生成，可以增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性，因此将抗血管生成疗法与放化对放化疗的敏感性，因此将抗血管生成疗法

59、与放化疗联合应用，有望取得更好的治疗效果。疗联合应用，有望取得更好的治疗效果。 Folkman Folkman的理论为肿瘤的治疗开辟了一条崭新的理论为肿瘤的治疗开辟了一条崭新的道路：抑制肿瘤的血管生成，阻断肿瘤的营养供的道路：抑制肿瘤的血管生成，阻断肿瘤的营养供给，可导致肿瘤的萎缩、退化；同时，抑制肿瘤新给，可导致肿瘤的萎缩、退化；同时，抑制肿瘤新生血管生成，还可以阻断肿瘤的血道转移，抑制转生血管生成，还可以阻断肿瘤的血道转移，抑制转移瘤的生长。移瘤的生长。 用血管生成抑制剂治疗肿瘤具有高效、低毒的用血管生成抑制剂治疗肿瘤具有高效、低毒的特点，不易产生耐药性，还可以增强放疗、化疗的特点，不易产

60、生耐药性，还可以增强放疗、化疗的效果，减少放、化疗的剂量，降低毒性。因此，抗效果，减少放、化疗的剂量，降低毒性。因此，抗血管生成疗法在肿瘤的治疗中有广阔的应用前景。血管生成疗法在肿瘤的治疗中有广阔的应用前景。 第五节第五节 肿瘤血管生成常用研究方法肿瘤血管生成常用研究方法 第一部分第一部分 体外实验体外实验第二部分第二部分 体内实验体内实验第三部分第三部分 整体实验整体实验第一部分第一部分 体外实验体外实验 1.1.血管内皮细胞分离培养方法血管内皮细胞分离培养方法 2.2.内皮细胞增殖实验内皮细胞增殖实验 3.3.胎盘血管培养实验胎盘血管培养实验 4.4.肿瘤微血管密度计数肿瘤微血管密度计数