定量PCR介绍PPT教案

1、会计学1定量定量PCR介绍介绍Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 2July 6, 2022July 6, 2022第1页/共80页Real Time PCR的用途的用途病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析导入基因拷贝数解析GMO定量检测定量检测差异显示结果验证差异显示结果验证基因芯片结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认效果确认mRNA表达

2、量分析表达量分析病毒及病原菌检测病毒及病原菌检测物种鉴定物种鉴定基因分型基因分型实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 3July 6, 2022July 6, 2022第2页/共80页Real Time PCRReal Time PCR的原理的原理 激发光激发光发射光发射光使用使用Real Time PCRReal Time PCR扩增装置实时监测扩增装置实时监测PCRPCR扩增产物并进行分析的方法扩增产物并进行分析的方法。Real Time PCRReal Time PCRCtCt值值实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4 4July 6, 2022July 6, 2022第3页/共8

3、0页Real Time PCRReal Time PCR的原理的原理同一个样品重复同一个样品重复9696次次PCRPCR的扩增曲线的扩增曲线 CtCt值值实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍5 5July 6, 2022July 6, 2022第4页/共80页Real Time PCRReal Time PCR扩增过程中，每个反应管内的扩增过程中，每个反应管内的荧光信号值荧光信号值达到设定的达到设定的阈值阈值时所经历的循环数。时所经历的循环数。 ( ( C-C-代表代表CycleCycle，t- t-代表代表thresholdthreshold） CtCt值概念值概念阈值阈值：在扩增曲线的：

4、在扩增曲线的指数增长区域指数增长区域内适当位置上设定的内适当位置上设定的荧光检出界限。荧光检出界限。Real Time PCRReal Time PCR中的概念中的概念实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍6 6July 6, 2022July 6, 2022第5页/共80页 在在PCRPCR反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个反应体系中加入荧光物质，并实时监测荧光信号积累的整个PCRPCR进程，进程，最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。最后通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。Real Time PCRReal Tim

5、e PCR的原理的原理实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍7 7July 6, 2022July 6, 2022第6页/共80页生产厂商生产厂商 仪器名称仪器名称 TaKaRaTaKaRa公司公司Thermal Cycler Dice TP800Thermal Cycler Dice TP800Applied BiosystemsApplied Biosystems公司公司ABI PRISM 7700ABI PRISM 7700、70007000、73007300、7900HT7900HT、 7500Fast7500FastRocheRoche公司公司LightCyclerLightCycl

6、er 2.0 2.0、LightCyclerLightCycler 480 480 CepheidCepheid公司公司Smart CyclerSmart Cycler、Smart Cycler IISmart Cycler II、Smart Cycler Smart Cycler TD TD Bio-RadBio-Rad公司公司iCycler iQiCycler iQ、iQ5 Real-Time PCR Detection SystemiQ5 Real-Time PCR Detection System Corbett ResearchCorbett Research公司公司Rotor-ge

7、ne2000Rotor-gene2000、Rotor-gene3000 Rotor-gene3000 、 Rotor-gene6000Rotor-gene6000 MJ ResearchMJ Research公司公司OpticonOpticon、MJ Mini CyclerMJ Mini Cycler、 MiniOpticonMiniOpticonStratageneStratagene公司公司Mx4000Mx4000、Mx3000PMx3000P 、Mx3005PMx3005PTMTM杭州博日杭州博日LINE-GENE FQD-33ALINE-GENE FQD-33A、LINE-GENE F

8、QD-66ALINE-GENE FQD-66AReal Time PCRReal Time PCR检测系统检测系统- -简介简介实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍July 6, 2022July 6, 2022第7页/共80页LightCycler 480 Rotor-gene6000 MiniOpticon Mx3005PTM LINE-GENE FQD-66A ABI PRISM 7500 iQ5 Real-Time PCR Detection System TaKaRa TP800实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍July 6, 2022July 6, 2022第8页/共80页仪

9、器名称仪器名称反应孔数反应孔数反应孔间反应孔间 独立性独立性检出通道检出通道升降温速度升降温速度TubeTubeROXROX荧光荧光校正功能校正功能TaKaRa Dice TP800TaKaRa Dice TP8009696无无2-42-4快快0.2ml0.2ml普通普通TubeTube无无ABI7000ABI70009696无无4 4快、慢两种快、慢两种0.2ml 80.2ml 8联管、联管、专用专用CapCap有有ABI7500 FastABI7500 Fast5 5快快Light Cycler2.0Light Cycler2.03232无无6 6快快专用毛细玻璃管专用毛细玻璃管无无Lig

10、ht Cycler 480Light Cycler 48096 or 38496 or 3845 5快快专用板专用板Smart Cycler Smart Cycler 16 (616 (616 ) 16 ) 有有4 4快快专用、塑料石英专用、塑料石英无无Rotor-Gene 3000Rotor-Gene 300036 (0.2ml)36 (0.2ml)72 (0.1ml)72 (0.1ml)无无4 4慢慢 0.2ml 0.2ml为普通为普通Tube,Tube,0.1ml0.1ml为专用为专用TubeTube无无MiniOpticonMiniOpticon4848无无2 2快快0.2ml0.2m

11、l普通普通TubeTube无无iQ5 Real-Time PCRiQ5 Real-Time PCR Detection System Detection System 9696无无5 5快快0.2ml0.2ml普通普通TubeTube无无LINE-GENE LINE-GENE FQD-66AFQD-66A6666无无4 4快快0.2ml0.2ml普通普通TubeTube无无Mx3000PMx3000P9696无无4 4慢慢0.2ml 80.2ml 8联管联管或单管或单管有有Mx3005PMx3005PTMTM5 5实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍July 6, 2022July 6, 2

12、022第9页/共80页Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的检测方法Real Time PCRReal Time PCR基础知识基础知识1实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 11 1July 6, 2022July 6, 2022第10页/共80页TaqManProbeTaqManProbeCyclingCyclingProbeProbeMolecularMolecularBeaconBeaconetc.荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法荧光探针法荧光探针法Real Time PCRRe

13、al Time PCR的检测方法的检测方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 12 2July 6, 2022July 6, 2022第11页/共80页荧光染料嵌合法（荧光染料嵌合法（SYBR Green ISYBR Green I）SYBR Green ISYBR Green I：是一种能结合于所有：是一种能结合于所有dsDNAdsDNA双螺旋小沟区域的双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。具有绿色激发波长的染料。实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 13 3July 6, 2022July 6, 2022第12页/共80页Primer退退 火火 FFFFSYBR Green

14、I 法法作用机理示意图作用机理示意图Pol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变热变性性 FFFF实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 14 4July 6, 2022July 6, 2022第13页/共80页TaqManTaqMan法作用机理法作用机理TaqManTaqMan探针为一寡核苷酸，探针为一寡核苷酸，5 5 端标记一个报告基团（端标记一个报告基团（ReporterReporter），），3 3 端标记一个淬灭基团（端标记一个淬灭基团（QuencherQuencher）。）。 RQ实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 15 5July 6, 2022

15、July 6, 2022第14页/共80页RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.热变热变性性 退退 火火 延延 伸伸 TaqMan ProbeTaqMan Probe法原理示意图法原理示意图 实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 16 6July 6, 2022July 6, 2022第15页/共80页CycleavePCRCycleavePCR法原理法原理 Cycling probeCycling probe为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基为一寡核苷酸，一端标记一个荧光报告基团（团（ReporterReporter），一端标记一个荧光淬灭基团（），一端标记一

16、个荧光淬灭基团（QuencherQuencher），），寡核苷酸为寡核苷酸为DNA/RNADNA/RNA杂合体。杂合体。 RNase HQRNAR实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 17 7July 6, 2022July 6, 2022第16页/共80页热变热变性性 PrimerQFPrimerPol.退退 火火 QFRNase HPrimerPol.延延 伸伸 QFCycleavePCRCycleavePCR法原理示意图法原理示意图 实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 18 8July 6, 2022July 6, 2022第17页/共80页 One-Step RT-PCR特异

17、性高特异性高多重多重PCRPCR检出检出ProbeProbe设计要求高设计要求高 ProbeProbe法法 ProbeProbe合成费用高合成费用高SYBR Green I SYBR Green I 法与法与ProbeProbe法比较法比较常用于常用于mRNAmRNA表达量分析等表达量分析等SYBR Green I SYBR Green I 法法 简便易行简便易行价格便宜价格便宜要求反应的特异性要求反应的特异性不能进行多重不能进行多重PCRPCR常用于常用于SNPSNP解析，病毒、病源菌检测解析，病毒、病源菌检测实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍1 19 9July 6, 2022July

18、 6, 2022第18页/共80页主主 要要 内内 容容2Real Time PCR实验方法 O One Stepne Step和和Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCR的选择的选择 RT Primer RT Primer的选择的选择 Total RNA Total RNA中中Genomic DNAGenomic DNA混入的对策混入的对策 Real Time PCR Real Time PCR引物及探针的设计引物及探针的设计 引物反应性确认引物反应性确认 PCR PCR条件优化顺序条件优化顺序实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 20 0July 6, 2022Ju

19、ly 6, 2022第19页/共80页O One Stepne Step和和Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCR的选择的选择Two-Step RT-PCRTwo-Step RT-PCRRNARNARTRT反应反应PCRPCR反反应应cDNAcDNAOne-Step RT-PCROne-Step RT-PCR实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 21 1July 6, 2022July 6, 2022第20页/共80页 Two-Step RT-PCRTwo-Step RT-PCR 高扩增效率高扩增效率cDNAcDNA使用更加灵活使用更加灵活更多更多RT PrimerR

20、T Primer选择选择常用于常用于mRNAmRNA表达量分析等表达量分析等 One-Step RT-PCR操作简便操作简便有效降低污染有效降低污染特异性特异性RT PrimerRT PrimerOne-Step RT-PCROne-Step RT-PCR 常用于病毒、病源菌检测等常用于病毒、病源菌检测等O One Stepne Step和和Two Step RT-PCRTwo Step RT-PCR的选择的选择实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 22 2July 6, 2022July 6, 2022第21页/共80页RTRT PrimerPrimer的选择的选择 Random Pri

21、merRandom Primer Oligo dT PrimerOligo dT Primer Gene Specific Primer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific PrimerGene Specific PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerPCR R-PrimerPCR R-PrimerPCR F-PrimerPCR F-Primer实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 23 3July 6, 2022July 6, 2022第22页/共80

22、页目的片段在距目的片段在距Poly(A) Tail Poly(A) Tail 1.5 kbp 1.5 kbp 以内适用，以内适用，RTRT效效率较高。率较高。One Step RT-PCR One Step RT-PCR 只能使只能使用用Gene Specific PrimerGene Specific Primer，但不适用于复数基因的检但不适用于复数基因的检出。出。5 53 3Gene Specific PrimerGene Specific Primer目的片段目的片段R RF FAAAAAA5 53 3目的片段目的片段R RF F1,500 base1,500 baseOligo dT

23、 PrimerOligo dT PrimerRandomRandom目的片段目的片段5 53 3R RF F目的片段在目的片段在mRNAmRNA任何位任何位置都能使用。通常置都能使用。通常mRNAmRNA表达量分析最适。表达量分析最适。Oligo dT PrimerOligo dT Primer5 53 3R RF FAAAAAA目的片段目的片段RandomRandom适用于适用于mRNAmRNA表达量分析表达量分析，提升反应检测的灵敏度，提升反应检测的灵敏度。RTRT PrimerPrimer的选择的选择实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 24 4July 6, 2022July 6,

24、 2022第23页/共80页Total RNATotal RNA中中Genomic DNAGenomic DNA混入的对策混入的对策PCR PrimerexonexonintronintronexonexonGenomic DNAGenomic DNAcDNAcDNAexonexonexonexonPCR PrimerReal Time PCRReal Time PCRReal Time RT-PCRReal Time RT-PCRSmall PCR ProductSmall PCR ProductSmall PCR ProductSmall PCR Product此种情况必须采用此种情况必须

25、采用DNase I DNase I 处理，去除基因组处理，去除基因组DNADNA。融解曲线分析融解曲线分析实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 25 5July 6, 2022July 6, 2022第24页/共80页PCR PrimerexonexonintronintronexonexonGenomic DNAGenomic DNAcDNAcDNAexonexonexonexonPCR PrimerReal Time PCRReal Time PCRReal Time RT-PCRReal Time RT-PCRLong PCR Product or No ProductLong PC

26、R Product or No ProductSmall PCR ProductSmall PCR Product融解曲线分析可以区分可以区分cDNAcDNA或者基因组或者基因组DNADNA来源的扩增产物来源的扩增产物。Total RNATotal RNA中中Genomic DNAGenomic DNA混入的对策混入的对策实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 26 6July 6, 2022July 6, 2022第25页/共80页PCR PrimerexonexonintronintronexonexonGenomic DNAGenomic DNAcDNAcDNAexonexonexon

27、exonPCR PrimerReal Time PCRReal Time PCRReal Time RT-PCRReal Time RT-PCR No Product No ProductSmall PCR ProductSmall PCR Product融解曲线分析Total RNATotal RNA中中Genomic DNAGenomic DNA混入的对策混入的对策实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 27 7July 6, 2022July 6, 2022第26页/共80页Real Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二目

28、的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。性反应和引物二聚体要求严格。Real Time PCRReal Time PCR用引物与普通用引物与普通PCRPCR引物设计要求不同引物设计要求不同= = 对引物设计要求严格对引物设计要求严格普通普通PCRPCR引物引物Real Time PCRReal Time PCR引物引物实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 28 8July 6, 2022July 6, 2022第27页/共80页两条引物的两条引

29、物的TmTm值尽量接近，应用专用软件计算值尽量接近，应用专用软件计算TmTm值值 TmTm值值40-60%(40-60%(最好最好45-55%)45-55%) GCGC含量含量PrimerPrimer长度长度80-150 bp(80-150 bp(尽量限制在尽量限制在300 bp300 bp以内以内) )扩增片段大扩增片段大小小17-25 base17-25 base使用使用BLASTBLAST检索，确认引物特异性检索，确认引物特异性 特异性特异性 引物内部或两条引物之间避免引物内部或两条引物之间避免3 base3 base以上的互补序列以上的互补序列 引物引物3 3 末端避免末端避免2 ba

30、se2 base以上的互补序列以上的互补序列 互补性互补性3 3 末端序列末端序列 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich(AT rich(特别是特别是3 3 端端) ) 避免避免T/CT/C连续，连续，A/GA/G连续连续序列序列 3 3 末端避免末端避免GC richGC rich或或AT richAT rich 3 3 末端碱基最好为末端碱基最好为G G 或或C C 3 3 末端碱基尽量避免为末端碱基尽量避免为T T尽量在尽量在Exon junctionExon junction上设计引物，限制基因组上设计引物，限制基

31、因组DNADNA扩增扩增 RT-PCRRT-PCR用引物用引物Real Time PCRReal Time PCR引物设计原则引物设计原则实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍2 29 9July 6, 2022July 6, 2022第28页/共80页RefSeqRefSeq序列序列目的基因序列获得目的基因序列获得引物设计引物设计分析序列分析序列特异性确认特异性确认基因组序列确认基因组序列确认目的基因目的基因Real Time RT-PCRReal Time RT-PCR引物引物好的引物好的引物需要寻找好的参照序列需要寻找好的参照序列Real Time PCRReal Time PCR引物设

32、计引物设计通过通过NCBINCBI获得参考序列和相关情报。获得参考序列和相关情报。RefSeqRefSeq数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。数据库提供无重复，准确性，完整性的基因参考序列。序列可信度高，信息量大序列可信度高，信息量大实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 30 0July 6, 2022July 6, 2022第29页/共80页LOCUS NM_008777 1959 bp mRNA linear ROD 15-APR-2005DEFINITION Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA.ACCESS

33、ION NM_008777VERSION NM_008777.1 GI:6679202SOURCE Mus musculus (house mouse)ORGANISM Mus musculusFEATURES Location/Qualifiersgene 1.1959 /gene=Pah /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473 CDS 48.1409 /gene=Pah /note=go_function: iron ion binding goid 0005506 /protein_id=NP_032803.1 /db_xref=GI:66792

34、03 /db_xref=GeneID:18478 /db_xref=MGI:97473ORIGIN 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgggcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgagg

35、agaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 361 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctgg

36、atgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggtgttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgg

37、a agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccatgtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcac

38、ctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa a

39、gtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381 gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaa

40、gaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gatttagata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagtGenBank fileNM_008777Mus musculus phenylalanine hydroxylase (Pah), mRNA.Real Time P

41、CRReal Time PCR引物设计引物设计目的基因序列获得目的基因序列获得引物设计引物设计分析序列分析序列特异性确认特异性确认基因组序列确认基因组序列确认目的基因目的基因Real Time RT-PCRReal Time RT-PCR引物引物实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 31 1July 6, 2022July 6, 2022第30页/共80页 1 aattcaaccc tgtgctaagc tagacacctc acttactgag agccagcatg gcagctgttg 61 tcctggagaa cggagtcctg agcagaaaac tctcagactt tgg

42、gcaggaa acaagttaca 121 tcgaagacaa ctccaatcaa aatggtgctg tatctctgat attctcactc aaagaggaag 181 ttggtgccct ggccaaggtc ctgcgcttat ttgaggagaa tgagatcaac ctgacacaca 241 ttgaatccag accttcccgt ttaaacaaag atgagtatga gtttttcacc tatctggata 301 agcgtagcaa gcccgtcctg ggcagcatca tcaagagcct gaggaacgac attggtgcca 3

43、61 ctgtccatga gctttcccga gacaaggaaa agaacacagt gccctggttc ccaaggacca 421 ttcaggagct ggacagattc gccaatcaga ttctcagcta tggagccgaa ctggatgcag 481 accacccagg ctttaaagat cctgtgtacc gggcgagacg aaagcagttt gctgacattg 541 cctacaacta ccgccatggg cagcccattc ctcgggtgga atacacagag gaggagagga 601 agacctgggg aacggt

44、gttc aggactctga aggccttgta taaaacacat gcctgctacg 661 agcacaacca catcttccct cttctggaaa agtactgcgg tttccgtgaa gacaacatcc 721 cgcagctgga agatgtttct cagtttctgc agacttgtac tggtttccgc ctccgtcctg 781 ttgctggctt actgtcgtct cgagatttct tgggtggcct ggccttccga gtcttccact 841 gcacacagta cattaggcat ggatctaagc ccat

45、gtacac acctgaacct gatatctgtc 901 atgaactctt gggacatgtg cccttgtttt cagatagaag ctttgcccag ttttctcagg 961 aaattgggct tgcatcgctg ggggcacctg atgagtacat tgagaaactg gccacaattt 1021 actggtttac tgtggagttt gggctttgca aggaaggaga ttctataaag gcatatggtg 1081 ctgggctctt gtcatccttt ggagaattac agtactgttt atcagacaag

46、ccaaagctcc 1141 tgcccctgga gctagagaag acagcctgcc aggagtatac tgtcacagag ttccgacctc 1201 tgtactatgt ggccgagagt ttcaatgatg ccaaggagaa agtgaggact tttgctgcca 1261 caatcccccg gcccttctcc gttcgctatg acccctacac tcaaagggtt gaggtcctgg 1321 ataatactca gcagttgaag aatttagctg actccattaa tagtgaggtt ggaatccttt 1381

47、gccatgccct gcagaaaata aagtcatgaa cagaaagtga cgtcatagac agaacttagg 1441 aggtcaacca aaaaaatctg ctgatagaag tatagtaact gcttcttttc cctgaagaag 1501 aaaagtttta tttgcaatgt cagcttttaa tatattttcc taacatagtg gaggatcacc 1561 aaataaatca atttctctga atgaaagtat attaaaaccc atcagtggta gatccttcag 1621 agtcacattt gattt

48、agata tctcagacct tcaatttggt ttaaaatgta atttctcagt 1681 tctcatcaac attcatcaaa tttgggactc atatcatttg ggctctgtct gttcatttttCCTGGCCAAGGTCCTGCGCCTGGCCAAGGTCCTGCGTTGGAACCAGGGCACTGTGTTTGGAACCAGGGCACTGTGTAAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTACAAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTACTTCAGAGTCCTGAACACCGTTCCTTCAGAGTCCTGAACACCGTTCCACTCTTGA

49、CTCTTGG GGACATGTGCCCTTGGACATGTGCCCTTGTCTTCTCTAGCTCCAGGGTCTTCTCTAGCTCCAGGGG GC CAAAGTCATGAACAGAAAGTGAAAAGTCATGAACAGAAAGTGAGTGATCCTCCACTATGTTAGGTGATCCTCCACTATGTTAGForwardForwardReverseReverseReal Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的基因序列获得目的基因序列获得引物设计引物设计分析序列分析序列特异性确认特异性确认基因组序列确认基因组序列确认目的基因目的基因Real Time RT-

50、PCRReal Time RT-PCR引物引物实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 32 2July 6, 2022July 6, 2022第31页/共80页CCTGGCCAAGGTCCTGCGCCTGGCCAAGGTCCTGCGTTGGAACCAGGGCACTGTGTTGGAACCAGGGCACTGTGT TAAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTACAAAGCAGTTTGCTGACATTGCCTACTTCAGAGTCCTGAACACCGTTCCTTCAGAGTCCTGAACACCGTTCCACTCTACTCTTGGTGGGACATGTGCCCTTGGACATGTGCCCTTGTC

51、TTCTCTAGCTTCTTCTCTAGCTCCACCAGGGGGGG GC CAAAGTCAAAAGTCAT TGAACAGAAAGTGAGAACAGAAAGTGAGTGATCCTCCACTATGTTAGGTGATCCTCCACTATGTTAGForwardReverse5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-5-3-3-3-3-3-3-3-3SNPSNP3 3 末端的末端的T T 3bp3bp互补互补Real Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的基因序列获得目的基因序列获得引物设计引物设计分析序列分析序列特异性确认特异性确认基因组序列确认基因组序列确认目的基因

52、目的基因Real Time RT-PCRReal Time RT-PCR引物引物实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 33 3July 6, 2022July 6, 2022第32页/共80页Real Time PCRReal Time PCR引物设计引物设计目的基因序列获得目的基因序列获得引物设计引物设计分析序列分析序列特异性确认特异性确认基因组序列确认基因组序列确认目的基因目的基因Real Time RT-PCRReal Time RT-PCR引物引物31实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 34 4July 6, 2022July 6, 2022第33页/共80页探针的探针的Tm

53、Tm比引物高比引物高8-108-10 TmTm值值20-24 bp20-24 bp ProbeProbe长度长度探针探针5 5 末端的第一个碱基不能是末端的第一个碱基不能是G G5 5 末端序列末端序列 目的序列目的序列GCGC含量相对较高的区域设计含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过偏整体上碱基不能过偏 个别部分避免个别部分避免GC richGC rich或或AT rich (AT rich (特别是特别是3 3 端端) )；避免；避免T/CT/C连续，连续，A/CA/C连续连续序列序列ProbeProbe内部或内部或ProbeProbe与两条引物之间避免与两条引物之间避免3 base3

54、 base以上的互补序以上的互补序列列 互补性互补性BLASTBLAST检索确认检索确认ProbeProbe特异性特异性 特异性特异性Real Time PCRReal Time PCR用用TaqManTaqMan探针设计原则探针设计原则Real Time PCRReal Time PCR探针设计原则探针设计原则实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 35 5July 6, 2022July 6, 2022第34页/共80页探针荧光标记物的选择探针荧光标记物的选择淬灭基团种类淬灭基团种类淬灭基团性质淬灭基团性质使用的报告基团的种类使用的报告基团的种类TAMRATAMRA荧光物质荧光物质FAM

55、FAM，HEXHEX，TETTET，JOEJOE等等EclipseEclipse非荧光物质非荧光物质FAMFAM，HEXHEX，TETTET，JOEJOE，TAMRATAMRA，ROXROX等等BHQBHQ系列染料系列染料BHQ1BHQ1非荧光物质非荧光物质FAMFAM，HEXHEX，TETTET，JOEJOE等等BHQ2BHQ2非荧光物质非荧光物质CY3CY3， TAMRATAMRA，ROXROX，TexasRedTexasRed，CY5CY5等等BHQ3BHQ3非荧光物质非荧光物质CY5CY5等等常用报告基团与淬灭基团的相匹配的探针组合常用报告基团与淬灭基团的相匹配的探针组合实时荧光定量实

56、时荧光定量PCR介绍介绍3 36 6July 6, 2022July 6, 2022第35页/共80页线性关系、扩增效率确认线性关系、扩增效率确认检测灵敏度确认检测灵敏度确认PCRPCR扩增效率（扩增效率（E E）：）：0.8-1.20.8-1.235Cycles35Cycles内可得到好的定量结果内可得到好的定量结果。如果采用如果采用SYBRSYBR检测方法，检测方法，30Cycles30Cycles内无非特异性产物扩增内无非特异性产物扩增。No No T Template emplate C Controlontrol确认确认30Cycles30Cycles内无引物二聚体产生内无引物二聚体

57、产生。相关系数（相关系数（r r2 2）：大于）：大于0.980.98反应性能确认反应性能确认实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 37 7July 6, 2022July 6, 2022第36页/共80页标准标准ProtocolProtocol95 5 sec.95 5 sec. 60 30 sec. 60 30 sec.B. B. 有非特异性扩增时有非特异性扩增时 提高退火、延伸温度提高退火、延伸温度 缩短退火、延伸时间缩短退火、延伸时间 降低引物浓度降低引物浓度PCRPCR条件优化顺序条件优化顺序A. A. 扩增效率低时扩增效率低时 延长退火、延伸时间延长退火、延伸时间 降低退火、延

58、伸温度降低退火、延伸温度 改为三步改为三步PCRPCR，降低退火温度，降低退火温度 提高引物浓度提高引物浓度实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 38 8July 6, 2022July 6, 2022第37页/共80页主主 要要 内内 容容3Real Time PCR解析方法1. 标准曲线分析2. 融解曲线分析3. 绝对定量和相对定量解析方法实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍3 39 9July 6, 2022July 6, 2022第38页/共80页标准曲线制作标准曲线制作扩增曲线扩增曲线标准曲线标准曲线标准品梯度的选择：标准品梯度的选择：5 56 6个梯度个梯度标准品稀释倍数的选

59、择：标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为标准品稀释倍数通常为5-105-1010105 5 10104 4 10103 3 10102 2 10101 1 10100 0 10105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10 101 1 10 100 0实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4 40 0July 6, 2022July 6, 2022第39页/共80页标准品的种类标准品的种类 基因组基因组DNADNA 质粒质粒 Total RNA & Total RNA & cDNAcDNA 体外转录体外转录RNARNADNADNA样品定量标准样品定量

60、标准品品 RNARNA样品定量标准品样品定量标准品实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4 41 1July 6, 2022July 6, 2022第40页/共80页质粒标准品的构建质粒标准品的构建紫色紫色 部分为部分为Real TimeReal Time引物区引物区红色红色 部分为标准品构建用引物区部分为标准品构建用引物区质粒标准品引物设计质粒标准品引物设计TCCTCCTGAGCGCAAGTACTC ATTGCCGACAGGATGCAGA实时荧光定量实时荧光定量PCR介绍介绍4 42 2July 6, 2022July 6, 2022第41页/共80页质粒标准品构建流质粒标准品构建流程程基因组基因组DNAD