四 培养基配制与无菌技术

1、一、实验目的一、实验目的 掌握微生物掌握微生物常规培养基的制备方法常规培养基的制备方法 学习学习无菌技术无菌技术 学习玻璃器皿的包扎学习玻璃器皿的包扎微生物培养基的配制微生物培养基的配制与无菌技术与无菌技术 二、实验内容二、实验内容1、6种培养基的配制种培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基（细菌）牛肉膏蛋白胨培养基（细菌） 高氏一号培养基（放线菌）高氏一号培养基（放线菌） 马丁氏培养基（真菌）马丁氏培养基（真菌） 淀粉培养基（淀粉水解试验）淀粉培养基（淀粉水解试验） 蛋白胨水培养基（吲哚试验）蛋白胨水培养基（吲哚试验） 葡萄糖蛋白胨水培养基（葡萄糖蛋白胨水培养基（V.P试验）试验）2、 移液管、培

2、养皿、三角瓶、试管等的包扎移液管、培养皿、三角瓶、试管等的包扎3、灭菌、灭菌微生物培养基的配制微生物培养基的配制 v 无菌水的无菌水的准备准备三、实验原理三、实验原理培养基培养基medium:用人工的办法将多种营养物质按微生用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的营养基质。物生长代谢的需要配制成的营养基质。水、水、C源、源、N源、矿物质、生长因素源、矿物质、生长因素/因子、微量元素因子、微量元素培养基种类：培养基种类：天然培养基、合成培养基、半合成培养基天然培养基、合成培养基、半合成培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基基础培养基、加富培

3、养基、选择性培养基、鉴别培养基基础培养基、加富培养基、选择性培养基、鉴别培养基微生物培养基的配制微生物培养基的配制 四、实验步骤四、实验步骤配制培养基的流程配制培养基的流程： 原料称量原料称量、溶解溶解 调节调节pHpH值值 ( (加琼脂熔化加琼脂熔化) ) ( (过滤过滤) )定容定容 分装分装 塞棉塞塞棉塞/ /扎扎口口 灭菌灭菌 培养基分装装置培养基分装装置 斜面摆放法斜面摆放法 棉棉塞的做法塞的做法a)a)棉棉塞的制作过程塞的制作过程 ( (b)b)正误正误棉塞棉塞培养皿的包扎培养皿的包扎 在在( (利用微生物利用微生物) )进行研究实验或生产过程中，进行研究实验或生产过程中，采用物理

4、和化学的方法技术，保证培养物不采用物理和化学的方法技术，保证培养物不受环境微生物的污染，同时也不允许操作的受环境微生物的污染，同时也不允许操作的微生物扩散到环境中去。微生物扩散到环境中去。 如高温灭菌、过滤、紫外线照射处理等。如高温灭菌、过滤、紫外线照射处理等。灭菌与消毒灭菌与消毒 灭菌灭菌Sterilization：用物理或化学的方法来杀死或用物理或化学的方法来杀死或除去材料上或环境中的所有微生物的处理。除去材料上或环境中的所有微生物的处理。 消毒消毒Disinfection：用物理或化学的方法杀死物体用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（主要是病原微生物和有害微生上绝大部分微生物（主

5、要是病原微生物和有害微生物）的处理。消毒实际上是部分灭菌。物）的处理。消毒实际上是部分灭菌。防腐防腐(Antisepsis)：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长化疗化疗(Chemotherapy)：杀死或抑制宿主体内的病原微生物杀死或抑制宿主体内的病原微生物抑制抑制(Inhibition)：生长停止，但不死亡生长停止，但不死亡死亡死亡(Death)：生长能力不可逆丧失生长能力不可逆丧失 干热灭菌干热灭菌 热蒸汽灭菌热蒸汽灭菌 常压灭菌常压灭菌 过滤除菌过滤除菌 射线灭菌射线灭菌 化学药物灭菌化学药物灭菌 1 1、火焰灭菌、火焰灭菌微生物接种工具如接

6、种环、接种针或其微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等可直接在酒精灯火焰上烧它金属用具等可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。至红热进行灭菌。这种方法灭菌迅速彻底。这种方法灭菌迅速彻底。接种过程中，试管或三角瓶口等，也可接种过程中，试管或三角瓶口等，也可通过火焰灼烧灭菌。通过火焰灼烧灭菌。用干燥热空气用干燥热空气（160, 12h）杀死微生物杀死微生物 培养皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接种、培养皿、漏斗、吸管、玻璃器具、解剖刀，接种、镊子、剪刀等能耐高温的器皿镊子、剪刀等能耐高温的器皿 晾干后用牛皮纸包好晾干后用牛皮纸包好 温度升到温度升到100100，开箱内鼓风机，开箱内鼓风机

7、 培养基、橡胶塑料制品不能用此方法培养基、橡胶塑料制品不能用此方法 注意安全注意安全干热灭菌箱干热灭菌箱鼓风钮温度调节器指示灯温度调节旋扭温度计与排气孔 常压蒸汽间歇灭菌常压蒸汽间歇灭菌 将待灭菌的培养基或物品装入常压灭菌器内，加热至将待灭菌的培养基或物品装入常压灭菌器内，加热至100100大量产生气体时大量产生气体时, ,维持维持30306060min,min,每天灭菌一次每天灭菌一次, ,连连续灭菌三天续灭菌三天. .每次蒸煮间隙里每次蒸煮间隙里, ,培养基或物品应放在室温培养基或物品应放在室温(20-30)(20-30)条件下培养条件下培养, ,第一次蒸煮杀死微生物的营养第一次蒸煮杀死微

8、生物的营养体体, ,芽孢则在培养过程中萌发成营养体芽孢则在培养过程中萌发成营养体; ;第二次蒸煮即可第二次蒸煮即可杀死杀死. .经过二次培养经过二次培养, ,三次反复蒸煮三次反复蒸煮, ,即可达到完全灭菌。即可达到完全灭菌。 常压蒸汽持续灭菌常压蒸汽持续灭菌 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌常压蒸汽间歇灭菌常压蒸汽间歇灭菌 常压蒸汽持续灭菌常压蒸汽持续灭菌 常压蒸汽持续灭菌中常压蒸汽持续灭菌中, ,从蒸汽大量产生开始从蒸汽大量产生开始, ,继续加继续加大火力保持充足蒸汽大火力保持充足蒸汽, ,持续加热持续加热3 36 6h,h,杀死绝大部分杀死绝大部分芽孢和全部营养体芽孢和全部营养体, ,达到灭菌目的

9、。达到灭菌目的。 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌原理：原理：水的沸点随压力的增加而提高。水在密闭的加压水的沸点随压力的增加而提高。水在密闭的加压蒸汽灭菌器中煮沸，产生蒸汽驱除锅内冷空气后，使蒸汽灭菌器中煮沸，产生蒸汽驱除锅内冷空气后，使蒸汽不能逸出，因而增加了锅中的蒸汽压力。蒸汽压蒸汽不能逸出，因而增加了锅中的蒸汽压力。蒸汽压力提高，水的沸点随着上升，因而能够获得比力提高，水的沸点随着上升，因而能够获得比100100更高的蒸汽温度，用来进行有效的灭菌。更高的蒸汽温度，用来进行有效的灭菌。同一温度下，湿热灭菌法比干热灭菌法效果好同一温度下，湿热灭菌法比干热灭菌法效果好蒸汽穿透

10、力强蒸汽穿透力强蛋白质含水量高，易于凝固蛋白质含水量高，易于凝固手提式灭菌锅手提式灭菌锅安全阀压力表放气阀软管紧固螺栓灭菌桶筛架水卧式灭菌锅卧式灭菌锅 是指含菌液体或气体通过细菌滤器，使杂菌留是指含菌液体或气体通过细菌滤器，使杂菌留在滤器或滤板上，从而除去杂菌。在滤器或滤板上，从而除去杂菌。 常用于许多不宜用湿热灭菌的液体物质，如常用于许多不宜用湿热灭菌的液体物质，如抗抗生素、血清、糖类溶液生素、血清、糖类溶液等。等。 用于除菌的细菌过滤器，是由孔径极小，能阻用于除菌的细菌过滤器，是由孔径极小，能阻止挡的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成止挡的陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃粉等制成. .为了加快过滤为

11、了加快过滤, ,一般多采用抽气减压的方法一般多采用抽气减压的方法, ,进进行操作。行操作。过滤除菌过滤除菌 辐射灭菌辐射灭菌( (Radiation Sterilization) )是利用是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效方法。上的微生物的一种有效方法。 用于灭菌的电磁波有微波，紫外线用于灭菌的电磁波有微波，紫外线( (UV)UV)、X-X-射线和射线和-射线等。射线等。 酚类酚类损伤微生物细胞壁和细胞膜、酶钝化、蛋白质变性损伤微生物细胞壁和细胞膜、酶钝化、蛋白质变性 醇类醇类溶解膜中的类脂，破坏膜结构，使蛋白变性（纯的或溶解膜中的类

12、脂，破坏膜结构，使蛋白变性（纯的或高浓度酒精使菌体表面蛋白凝固，使乙醇不易渗进细胞）高浓度酒精使菌体表面蛋白凝固，使乙醇不易渗进细胞） 醛类醛类与蛋白质中氨基酸的多种基团共价结合而使其变性与蛋白质中氨基酸的多种基团共价结合而使其变性 酸类酸类抑制微生物酶和代谢活性抑制微生物酶和代谢活性 表面活性剂表面活性剂改变细胞的稳定性和透性，细胞物质逸出改变细胞的稳定性和透性，细胞物质逸出 卤化物卤化物与细胞中的酶和蛋白质中的酪氨酸结合，与细胞中的酶和蛋白质中的酪氨酸结合，ClCl2 2和漂和漂白粉产生次氯酸和新生态氧（强氧化剂），破坏细胞膜结构白粉产生次氯酸和新生态氧（强氧化剂），破坏细胞膜结构作用机理

13、：作用机理： 重金属重金属与酶或蛋白质上的与酶或蛋白质上的SHSH结合结合 氧化剂氧化剂使细胞成份氧化使细胞成份氧化 染色剂染色剂碱性染料的阳离子基团与蛋白质氨基酸上的羧基或核酸上的碱性染料的阳离子基团与蛋白质氨基酸上的羧基或核酸上的 磷酸基结合，阻碍正常代谢磷酸基结合，阻碍正常代谢 抗生素抗生素多种机理：作用于细胞壁、膜、蛋白质、核酸等大分子合成多种机理：作用于细胞壁、膜、蛋白质、核酸等大分子合成 抗代谢物抗代谢物竞争抑制，如磺胺类药物于对氨基苯甲酸类似，阻止叶竞争抑制，如磺胺类药物于对氨基苯甲酸类似，阻止叶 酸的合成酸的合成 作用机理：作用机理：墙壁光滑，地面平坦，避免积累灰尘，便于清洗消

14、毒；不装墙壁光滑，地面平坦，避免积累灰尘，便于清洗消毒；不装风扇，通风换气通过空气调节装置风扇，通风换气通过空气调节装置 使用前，用使用前，用2%2%新洁尔敏擦洗新洁尔敏擦洗 再用再用75%75%酒精（或酒精（或5%5%石炭酸）喷雾，使灰尘落下石炭酸）喷雾，使灰尘落下 最后用紫外灯照射约最后用紫外灯照射约2020minmin 定期熏蒸：一年二定期熏蒸：一年二 四次四次 用用40%40%甲醛（甲醛（6 6 1010ml/mml/m3 3 ) )或加半量高锰酸钾熏蒸，盛于或加半量高锰酸钾熏蒸，盛于铁制容器，电炉或酒精灯加热（应能随时终止热源），铁制容器，电炉或酒精灯加热（应能随时终止热源），熏蒸后

15、密闭熏蒸后密闭1212h h以上，使用前以上，使用前1 1 2 2h h用氨水中和。用氨水中和。 其他熏蒸剂；乳酸（对细菌）、硫磺其他熏蒸剂；乳酸（对细菌）、硫磺升汞（升汞（ 0.1% HgCl2）漂白粉漂白粉10g/150mlNaClO（2-10%）酒精酒精75%苯酚（苯酚（1%）福尔马林（福尔马林（5%）过氧化氢（过氧化氢（3%）氰化汞（氰化汞（0.1%）高锰酸钾（高锰酸钾（2%）硝酸银硝酸银(0.1%) 酸性培养基酸性培养基: 如10ml培养基中加三滴25%的乳酸 孟加拉红：孟加拉红：0.035 g /L培养基 抗菌素抗菌素:金霉素（30g/ml）可抑制多数细菌;青霉素（20g/ml）可抑制G+细菌;多粘霉素（5.0g/ml）可抑制G-细菌;链霉素(40g/ml)和氯霉素(50g/ml)可抑制大部细菌. 除氯霉素可灭菌前加入外，其它抗菌素都是在培养基灭除氯霉素可灭菌前加入外，其它抗菌素都是在培养基灭菌后并冷却到菌后并冷却到45左右时加入左右时加入. 双层培养基或