基因工程载体

1、3 基因工程载体3.1 3.1 质粒载体质粒载体3.2 3.2 噬菌体噬菌体3.3 3.3 单链单链DNADNA噬菌体噬菌体3.4 3.4 黏粒载体黏粒载体3.5 3.5 其他载体其他载体3.6 3.6 表达载体表达载体l载体：基因工程中携带外源基因进入受体细基因工程中携带外源基因进入受体细胞的胞的“运载工具运载工具”，它的本质是，它的本质是DNA复制子。复制子。l作为载体必备的作为载体必备的3 3个基本条件：个基本条件： I I 能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制能在宿主细胞内独立和稳定的自我复制 II II 具有合适的限制性酶切位点具有合适的限制性酶切位点 III III 具有合适的选择标

2、记基因具有合适的选择标记基因3.1 3.1 质粒载体质粒载体l质粒：染色体外能自我复制的小型DNA分子。l广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中。蓝藻、酵母和少数动植物细胞中。l大小大小1Kb-200Kb。l携带基因，可以赋予宿主某些生物特性：携带基因，可以赋予宿主某些生物特性： 抗生素抗性、降解复杂的有机物、产生限制酶和修饰酶等。3.1.13.1.1质粒的一般特性质粒的一般特性（1 1）质粒的分子特性）质粒的分子特性（2 2）质粒的复制类型）质粒的复制类型（3 3）质粒的不亲和性）质粒的不亲和性（4 4）质粒的转移性）质粒的转移性

3、（1 1）质粒的分子特性）质粒的分子特性l绝大多数是双链闭合环状绝大多数是双链闭合环状DNA分子。分子。l具有三种不同构型：具有三种不同构型： ccDNA：闭合环状DNA，呈SC构型； ocDNA：开环DNA，呈OC构型； lDNA：线形DNA，呈L构型。（2 2）质粒的复制类型）质粒的复制类型l严谨型质粒：拷贝数较少，严谨型质粒：拷贝数较少，1-3个拷贝；受个拷贝；受宿主染色体宿主染色体DNA复制的严格控制。复制的严格控制。l松弛型质粒：拷贝数较多，松弛型质粒：拷贝数较多，10-200个拷贝，个拷贝，有时可达有时可达700个拷贝。个拷贝。（3 3）质粒的不亲和性）质粒的不亲和性l质粒的不亲和

4、性：质粒的不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同的质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定的共存的现象。l不亲和群：不亲和群：将具有不亲和性的质粒划为一类，称为一个不亲和群。ColE1ColE1和和pMB1pMB1及派生质粒属于同一个不亲和群，及派生质粒属于同一个不亲和群，p15Ap15A及派生质粒属于同一个不亲和群，及派生质粒属于同一个不亲和群，pSC101pSC101、F F和和RP4RP4质粒属于不同的不亲和群。质粒属于不同的不亲和群。（4 4）质粒的转移性）质粒的转移性l质粒的转移性：质粒的转移性：从一个细胞转移到另一个细胞的特性。l根据质粒是否带有控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可分

5、为：接合型质粒：接合型质粒：F因子；多属于严谨型质粒。非接合型质粒：非接合型质粒：如ColE1质粒；用于基因工程。3.1.23.1.2理想质粒载体的必备条件理想质粒载体的必备条件l具有较小的分子量和较高的拷贝数；具有较小的分子量和较高的拷贝数；l具有若干限制性内切酶的单一酶切位点；具有若干限制性内切酶的单一酶切位点； MCSMCS：多克隆位点：多克隆位点l具有两种以上的选择标记基因；具有两种以上的选择标记基因；l缺失缺失mobmob基因基因l插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。胞并复制和表达。3.1.3 3.1.3 质粒载体的构建质粒载体的构

6、建pBR322的构建步骤3.1.4 3.1.4 常用的质粒载体类型常用的质粒载体类型(1) (1) 克隆质粒载体克隆质粒载体(2) (2) 表达质粒载体表达质粒载体(3) (3) 多功能质粒载体多功能质粒载体(4) (4) 穿梭质粒载体穿梭质粒载体(1) (1) 克隆质粒载体克隆质粒载体l用于基因或用于基因或DNA片段无性繁殖。片段无性繁殖。l目前常用的克隆质粒载体有：目前常用的克隆质粒载体有： pBR322、pUC、及其派生质粒。互补互补LacZM15LacZ蓝色产物蓝色产物X-galIPTGpUCpUC比比pBR22pBR22更理想更理想l更小的分子量；更小的分子量；l利用组织化学法筛选重

7、组体，方便省时；利用组织化学法筛选重组体，方便省时；l具有多克隆位点；具有多克隆位点；l拷贝数更多。拷贝数更多。(2) (2) 表达质粒载体表达质粒载体l表达载体：表达载体：专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。l表达质粒载体的特点：表达质粒载体的特点： 具有强启动子； 具有核糖体结合位点（S-D序列）； 具有转录终止序列。(3) (3) 多功能质粒载体多功能质粒载体具有多种功能，可以根据需要进行体外转录、克隆、具有多种功能，可以根据需要进行体外转录、克隆、测序、基因表达等方面的基因操作。测序、基因表达等方面的基因操作。如如pGEM系列质粒。系列质粒。(4)(4)穿梭质粒载体穿梭质

8、粒载体l穿梭质粒载体：穿梭质粒载体：由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。l常见的穿梭载体：常见的穿梭载体： 大肠杆菌大肠杆菌- -土壤农杆菌穿梭载体、土壤农杆菌穿梭载体、 大肠杆菌大肠杆菌- -枯草芽孢杆菌穿梭载体、枯草芽孢杆菌穿梭载体、 大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母穿梭载体、酿酒酵母穿梭载体、 3.2 3.2 噬菌体噬菌体调节区调节区重组区重组区复制区复制区结构基因结构基因非必需区非必需区：基因基因J与基因与基因N之之间的间的DNA区段。区段。3.2.2 3.2.2 噬菌体载体的构建噬菌体载体的构建l野生野生噬菌体不适合做载体：噬

9、菌体不适合做载体： 基因组大而复杂，含有常用限制酶的多个识别位点；基因组大而复杂，含有常用限制酶的多个识别位点； 噬菌体外壳只能接纳一定长度的噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNADNA分子。分子。l对对噬菌体的改造以满足基因工程需要：噬菌体的改造以满足基因工程需要： 切除掉非必需区段，扩大载体容量；切除掉非必需区段，扩大载体容量； 除去多余的限制酶识别位点；除去多余的限制酶识别位点； 引入适当的选择标记，以方便筛选；引入适当的选择标记，以方便筛选； 通过在某些必需基因引入无义突变使之称为安全载体。通过在某些必需基因引入无义突变使之称为安全载体。3.2.3 3.2.3 常用的常用的噬菌体载体噬菌体

10、载体l 噬菌体载体的分类：噬菌体载体的分类： 插入型载体：插入型载体：具有一个限制酶的识别位点供外源具有一个限制酶的识别位点供外源DNADNA插入。插入。容量一般在容量一般在10Kb10Kb之内。之内。 半乳糖苷酶失活：半乳糖苷酶失活：gt11gt11、gt18gt182323、Charon2.Charon2. 免疫功能失活：免疫功能失活：gt10gt10、NM1149NM1149、Charon6Charon6、Charon7.Charon7. ZAPZAP插入型载体。插入型载体。 替代型载体：替代型载体：具有两个限制酶识别位点，它们之间的具有两个限制酶识别位点，它们之间的DNADNA区区段可

11、被外源段可被外源DNADNA取代。容量为取代。容量为20Kb20Kb。 CharonCharon系列：系列：Charon32Charon323535、Charon40Charon40、Charon21A.Charon21A. EMBLEMBL系列：系列：EMBL3EMBL3、EMBL4EMBL4、EMBL3A.EMBL3A. SpiSpi- -正选择取代型：正选择取代型：L47L47、20012001、EMBLEMBL. .ZAPZAP插入型载体插入型载体3.3 M133.3 M13噬菌体噬菌体l 丝状大肠杆菌噬菌体：丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd。l DNA为单链环状为单链环状,大

12、大小小6.4Kb。l M13、f1、fd的的DNA同源性较高。同源性较高。l 编码编码10个基因。个基因。l 含有少量间隔区：含有少量间隔区：2和和5之间，之间，3和和7之间。之间。3.3.1 M133.3.1 M13噬菌体的生活史噬菌体的生活史3.3.2 M133.3.2 M13噬菌体载体噬菌体载体优越性：优越性：l不存在包装限制问不存在包装限制问题；题；l可产生大量含有外可产生大量含有外源源DNA的单链的单链DNA分子；分子；l可以测定外源可以测定外源DNA片段的插入方向；片段的插入方向；l也可以制备双链的也可以制备双链的复制型复制型DNA；l两种形式的两种形式的DNA都都能侵染大肠杆菌。

13、能侵染大肠杆菌。3.3.3 M133.3.3 M13噬菌体载体的用途噬菌体载体的用途l利用成对的载体克利用成对的载体克隆，外源隆，外源DNADNA能按彼能按彼此相反的取向插入此相反的取向插入到载体上，有利于到载体上，有利于测序；测序；l制备制备DNADNA探针；探针；l基因定点突变。基因定点突变。3.3.4 3.3.4 噬菌粒载体噬菌粒载体M13噬菌体载体的不足：噬菌体载体的不足：l插入外源片段不稳定，片段越大越容易发生缺失或插入外源片段不稳定，片段越大越容易发生缺失或重排，最大克隆能力为重排，最大克隆能力为1.5Kbl理论上片段插入有两种方向，其实总是按一种主要理论上片段插入有两种方向，其实

14、总是按一种主要的方向插入。的方向插入。噬菌粒载体汇集了质粒和丝状噬菌体载体的优点：噬菌粒载体汇集了质粒和丝状噬菌体载体的优点：l分子较小，约分子较小，约3Kb，克隆能力为，克隆能力为10Kb；l既含有质粒复制起点也含有丝状噬菌体复制起点；既含有质粒复制起点也含有丝状噬菌体复制起点；l具有多种功能：具有多种功能：DNADNA片段克隆、定点突变、测序、体外转录和翻译片段克隆、定点突变、测序、体外转录和翻译。pUC119pUC1193.4 3.4 黏粒载体黏粒载体l 又称柯斯质粒载体；又称柯斯质粒载体；l 具有更高的克隆能力：具有更高的克隆能力：35-45Kb；l 含有含有噬菌体的噬菌体的cos位点

15、及一些相关蛋白，能够环位点及一些相关蛋白，能够环化、体外包装及高效感染；化、体外包装及高效感染；l 具有质粒载体的易操作、选择及高拷贝数等特性；具有质粒载体的易操作、选择及高拷贝数等特性；l 具有与同源序列的质粒进行重组的能力。具有与同源序列的质粒进行重组的能力。黏粒载体的应用黏粒载体的应用l黏粒克隆：应用黏粒载体克隆真核基因组黏粒克隆：应用黏粒载体克隆真核基因组大片段的技术。大片段的技术。l插入片段两端插入插入片段两端插入T3T3和和T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶启动子，可以体外转录，制备启动子，可以体外转录，制备RNARNA探针。探针。l插入真核细胞病毒复制起点及相关选择标插入真核细胞病毒复制起点及相关选择标记，构建穿梭载体。记，构建穿